李關(guān)寧，楊振淮，耿燚

0 引言

肝癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，腫瘤病灶的血供豐富、癌細(xì)胞的增殖和侵襲活力旺盛，確診時(shí)多已發(fā)展至中晚期、預(yù)后較差。目前，臨床上用于肝癌治療的手段包括手術(shù)切除、放化療、熱療、射頻消融、靶向藥物等，但療效并不理想[1-2]。因此，探尋肝癌治療的新藥具有迫切的臨床價(jià)值。近年來，中藥材的抗腫瘤價(jià)值受到了越來越多的關(guān)注。蛇葡萄素（ampelopsin,AMP）是從粵蛇葡萄及顯齒蛇葡萄中提取得到的黃酮類化合物，已經(jīng)在多種惡性腫瘤中被證實(shí)具有抗癌活性[3]。Dermcidin蛋白是新發(fā)現(xiàn)的與肝癌病理進(jìn)程密切相關(guān)的一種蛋白，由dermcidin基因編碼并且在肝癌組織中呈高表達(dá)的趨勢(shì)[4]。本研究擬通過離體培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株HepG2來驗(yàn)證AMP對(duì)細(xì)胞侵襲活力及侵襲基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA（siRNA）的方式來敲低dermcidin基因的表達(dá)并明確AMP在肝癌細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)是否由dermcidin基因介導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肝癌細(xì)胞株HepG2購于美國ATCC細(xì)胞公司，細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640及胎牛血清購于美國Gibco公司，AMP購于成都曼斯特公司，Transwell小室購于美國Millipore公司，Matrigel基質(zhì)膠購于美國BD公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司，dermcidin基因的siRNA及陰性對(duì)照（NC）siRNA購于上海吉瑪公司，熒光定量PCR檢測(cè)所用引物購于上海生工公司、試劑盒購于北京天根公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞株HepG2用含有10%胎牛血清的RPMI 1640在培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為100%飽和濕度、5%CO2、37℃，細(xì)胞密度生長至90%后用胰蛋白酶進(jìn)行消化，消化后的細(xì)胞繼續(xù)傳代并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞處理 細(xì)胞接種在培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞密度生長至80%～90%后進(jìn)行處理，對(duì)照組處理?xiàng)l件為不含血清及藥物的RPMI 1640，AMP組處理?xiàng)l件為含有不同劑量AMP的無血清RPMI 1640（AMP終濃度為20、40、60、80 μmol/L）；siRNA轉(zhuǎn)染采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，在含有80 μmol/L AMP的無血清RPMI 1640中轉(zhuǎn)染dermcidin基因的siRNA。

1.2.3 細(xì)胞遷移及侵襲的Transwell檢測(cè) 將細(xì)胞接種在預(yù)先涂有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室及未涂Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室，不同條件處理后24 h用棉簽擦拭Transwell小室內(nèi)膜的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色15 min后在40倍的高倍視野下隨機(jī)觀察4個(gè)視野，計(jì)數(shù)后計(jì)算平均數(shù)。

1.2.4 基因mRNA表達(dá)量的檢測(cè) 將細(xì)胞接種在12孔細(xì)胞板內(nèi)，不同條件處理后24 h棄去培養(yǎng)液，保留細(xì)胞并用PBS緩沖液清洗2遍。采用試劑盒抽提細(xì)胞內(nèi)的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照cDNA 2 μl、含酶的PCR反應(yīng)混合液10 μl、5 μmol/L的引物混合液0.8 μl、去離子水7.2 μl的方案配置反應(yīng)體系，按照95℃ 20 s、基因特異性退火溫度15 s、72℃ 25 s的反應(yīng)程序重復(fù)40次，在軟件中生成反應(yīng)曲線后讀取循環(huán)閾值（cycle threshold, Ct），根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算基因的mRNA表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件錄入數(shù)據(jù)，計(jì)量資料的兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AMP對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)節(jié)作用

在不含Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室內(nèi)，不同劑量AMP處理后細(xì)胞的遷移數(shù)目均低于對(duì)照組，且AMP劑量越大、細(xì)胞的遷移數(shù)目越少，20、40、60、80 μmol/L AMP組與對(duì)照組相比，P值依次為0.002、9.777×10-5、9.678×10-6、2.401×10-6，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1；在含有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室內(nèi)，不同劑量AMP處理后細(xì)胞的侵襲數(shù)目均低于對(duì)照組且AMP劑量越大、細(xì)胞的侵襲數(shù)目越少，20、40、60、80 μmol/L AMP組與對(duì)照組相比，P值依次為0.002、2.390×10-5、2.585×10-6、6.013×10-7，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖1 AMP處理后HepG2細(xì)胞在不含Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室內(nèi)的遷移數(shù)目Figure 1 Number of migration HepG2 cells treated with AMP in Transwell chamber without Matrigel

圖2 AMP處理后HepG2細(xì)胞在含有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室內(nèi)的侵襲數(shù)目Figure2 Number of invadsion HepG2 cells treated with AMP in Transwell chamber without Matrigel

2.2 AMP對(duì)HepG2細(xì)胞中Dermcidin mRNA水平的調(diào)節(jié)作用

對(duì)照組中Dermcidin mRNA水平為（1.09±0.17），20、40、60和80 μmol/L劑量AMP處理后細(xì)胞中Dermcidin mRNA水平分別為（0.85±0.12）、（0.67±0.07）、（0.51±0.07）和（0.39±0.05）。不同劑量AMP處理后，細(xì)胞中Dermcidin mRNA水平均降低，且AMP劑量越大、細(xì)胞Dermcidin mRNA水平越低，20、40、60、80 μmol/L AMP組與對(duì)照組相比，P值依次為0.018、0.0002、1.583×10-5、2.147×10-6，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖3 AMP處理后HepG2細(xì)胞中Dermcidin mRNA的表達(dá)水平Figure3 Expression of Dermcidin mRNA in HepG2 cells treated with AMP

2.3 AMP對(duì)HepG2細(xì)胞中侵襲基因mRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用

不同劑量AMP處理后，細(xì)胞中MMP2、MMP9和MMP10 mRNA水平均降低，且AMP劑量越大，細(xì)胞中MMP2、MMP9和MMP10 mRNA水平越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 AMP處理后HepG2細(xì)胞中侵襲基因mRNA的表達(dá)水平Table1 Expression of invasion gene mRNA in HepG2 cells treated with AMP

2.4 AMP聯(lián)合Dermcidin siRNA對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目、侵襲基因mRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用

在含有80 μmol/L AMP的RPMI 1640中轉(zhuǎn)染dermcidin基因的siRNA，與80 μmol/L AMP處理組比較，細(xì)胞的遷移、侵襲數(shù)目以及細(xì)胞內(nèi)MMP2、MMP9和MMP10 mRNA的表達(dá)水平均增多，見圖4～5、表2。

圖4 AMP聯(lián)合dermcidin siRNA后HepG2細(xì)胞的遷移數(shù)目Figure4 Number of migration HepG2 cells treated with AMP combined with dermcidin gene siRNA transfection

圖5 AMP聯(lián)合dermcidin siRNA后HepG2細(xì)胞的侵襲數(shù)目Figure5 Number of invasion HepG2 cells treated with AMP combined with dermcidin gene siRNA transfection

表2 AMP處理轉(zhuǎn)染dermcidin基因的siRNA后HepG2細(xì)胞中侵襲基因mRNA的表達(dá)水平Table2 Expression of invasion gene mRNA in HepG2 cells treated with AMP combined with dermcidin gene siRNA transfection

3 討論

肝癌具有惡性程度高、容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率較低、預(yù)后較差的特點(diǎn)，病灶內(nèi)癌細(xì)胞侵襲活力的過度增強(qiáng)是與肝癌預(yù)后密切相關(guān)的病理環(huán)節(jié)，抑制肝癌細(xì)胞的侵襲活力被認(rèn)為是治療疾病的潛在靶點(diǎn)[5-6]。AMP是從粵蛇葡萄及顯齒蛇葡萄中提取的抗癌活性物質(zhì)，在乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中被證實(shí)具有確切的抗癌活性[7-8]。本研究在Transwell小室內(nèi)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞并用AMP進(jìn)行處理，肝癌細(xì)胞在預(yù)先涂有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室及未涂Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室內(nèi)的移動(dòng)分別能夠反應(yīng)細(xì)胞的侵襲和遷移，分析結(jié)果顯示：AMP能夠以劑量依賴性的方式降低肝癌細(xì)胞在Transwell小室內(nèi)的侵襲和遷移數(shù)目，AMP劑量越大、肝癌細(xì)胞侵襲和遷移受抑制的效應(yīng)越顯著，進(jìn)而也表明AMP能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的侵襲活力。

肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程依賴多種蛋白酶的水解活性，MMP2、MMP9和MMP10是目前已知與肝癌侵襲密切相關(guān)的MMPs成員[9-11]，本研究進(jìn)一步分析了AMP處理對(duì)肝癌細(xì)胞中MMP2、MMP9和MMP10表達(dá)的影響并發(fā)現(xiàn)：AMP能夠以劑量依賴性的方式降低肝癌細(xì)胞中MMP2、MMP9和MMP10 mRNA表達(dá)水平，且AMP劑量越大，肝癌細(xì)胞中MMP2、MMP9和MMP10表達(dá)受抑制的效應(yīng)越顯著。MMP2、MMP9和MMP10的生物學(xué)活性是參與細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜中膠原蛋白、層黏連蛋白、彈性蛋白等成分的水解；在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜內(nèi)含有豐富的蛋白成分，能夠使細(xì)胞錨定于局部組織、抑制細(xì)胞向遠(yuǎn)處移動(dòng)；而在本實(shí)驗(yàn)中，AMP以劑量依賴性的方式降低MMP2、MMP9和MMP10的表達(dá)后，蛋白酶水解細(xì)胞外基質(zhì)的能力減弱，進(jìn)而使細(xì)胞的遷移和侵襲過程受到阻礙。以上MMPs相關(guān)的結(jié)果表明，AMP能夠有效抑制肝癌細(xì)胞中多種MMPs的表達(dá)，進(jìn)而使MMP所介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜水解效應(yīng)受阻并降低肝癌細(xì)胞的侵襲活力。

在明確AMP能夠降低肝癌細(xì)胞侵襲活力后，需要進(jìn)一步明確AMP發(fā)生該效應(yīng)的分子機(jī)制。dermcidin基因所編碼的Dermcidin蛋白是在肝癌病灶內(nèi)高表達(dá)的蛋白，且參與了肝癌的病理進(jìn)程[12-13]，我們通過分析AMP處理后細(xì)胞內(nèi)dermcidin基因表達(dá)的變化可知：AMP能夠以劑量依賴性的方式降低肝癌細(xì)胞中Dermcidin的mRNA表達(dá)水平且AMP劑量越大，肝癌細(xì)胞中Dermcidin表達(dá)受抑制的效應(yīng)越顯著。這一結(jié)果表明AMP能夠降低肝癌細(xì)胞中Dermcidin的表達(dá)，結(jié)合Dermcidin的生物學(xué)功能提示AMP能夠通過下調(diào)Dermcidin的表達(dá)來影響肝癌細(xì)胞的侵襲活力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一推測(cè)，我們通過轉(zhuǎn)染siRNA的方式來抑制肝癌細(xì)胞中Dermcidin的表達(dá)，在AMP處理的同時(shí)抑制Dermcidin的表達(dá)并觀察侵襲活力的變化可知：轉(zhuǎn)染Dermcidin siRNA能夠使AMP降低肝癌細(xì)胞遷移侵襲能力、侵襲基因表達(dá)的效應(yīng)發(fā)生逆轉(zhuǎn)。由此提示AMP抑制肝癌細(xì)胞侵襲活力的效應(yīng)部分由Dermcidin介導(dǎo)，也說明AMP能夠通過下調(diào)Dermcidin蛋白的表達(dá)來降低肝癌細(xì)胞的侵襲活力。

以上研究結(jié)果表明，AMP對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲活力以及細(xì)胞內(nèi)侵襲基因的表達(dá)具有顯著的抑制作用，且抑制Dermcidin蛋白的表達(dá)是AMP發(fā)揮侵襲抑制活性的分子途徑之一。