陳婷，林萬(wàn)尊，鄭偉麗，謝賢和，王自力

0 引言

腫瘤微環(huán)境可以通過(guò)多種機(jī)制導(dǎo)致免疫逃逸，其中程序性死亡受體1（PD-1）介導(dǎo)信號(hào)發(fā)揮關(guān)鍵作用。PD-1是一種Ⅰ型跨膜蛋白受體，表達(dá)于多種免疫細(xì)胞（包括活化的T細(xì)胞）表面，部分腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-1配體PD-L1，PD-1與配體結(jié)合后誘導(dǎo)T細(xì)胞功能障礙，即T細(xì)胞衰竭，衰竭型T細(xì)胞無(wú)法合成IFN-γ。臨床上廣泛應(yīng)用的抗PD-1治療就是為了挽救衰竭型T細(xì)胞[1-3]。Tumeh等[4]指出抗PD-1治療黑色素瘤有效的前提是治療前腫瘤組織中存在能被PD-1信號(hào)調(diào)節(jié)的CD8+T細(xì)胞。然而，PD-1在T細(xì)胞活化后的哪個(gè)階段開(kāi)始表達(dá)并抑制T細(xì)胞功能？是否所有表達(dá)PD-1的T細(xì)胞都是衰竭型T細(xì)胞？這些問(wèn)題仍不明確。因此，本課題聚焦T細(xì)胞的活化階段，研究T細(xì)胞活化初期PD-1表達(dá)情況。

Poly I:C是合成的雙鏈RNA類(lèi)似物，為T(mén)oll樣受體3（TLR3）配體，TLR3廣泛分布于多種免疫細(xì)胞表面，包括樹(shù)突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等。Poly I:C與受體結(jié)合后能有效激活非特異性免疫系統(tǒng)并促進(jìn)T細(xì)胞活化[5-6]。我們以黑色素瘤荷瘤小鼠為模型，研究發(fā)現(xiàn)Poly I:C可以有效促進(jìn)T細(xì)胞活化；同時(shí)，小鼠經(jīng)OVA肽+Poly I:C免疫后7天，處于活化早期階段的（仍在脾組織內(nèi)，還未向靶器官遷移的）特異性CD8+T細(xì)胞表達(dá)PD-1，這部分細(xì)胞仍然具有功能，可以合成T細(xì)胞功能性標(biāo)志IFN-γ。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑、材料與儀器

健康清潔級(jí)6～8周齡雌性C57BL/6小鼠購(gòu)于上海斯萊克公司。B16F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。雞卵清蛋白（OVA257-264）抗原肽（OVA肽）：SIINFEKL合成于上海淘普生物技術(shù)公司。CD8體內(nèi)敲除抗體購(gòu)于美國(guó)InvivoMab公司。Poly I:C購(gòu)于美國(guó)InvivoGen公司。FITC標(biāo)記的抗鼠CD3抗體、APC標(biāo)記的抗鼠CD3抗體、PE標(biāo)記的抗鼠IFN-γ抗體、Percp cy5.5標(biāo)記的抗鼠CD8抗體、APC標(biāo)記的抗鼠CD4抗體和FITC標(biāo)記的抗鼠PD-1抗體購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司。胞內(nèi)染色試劑盒和PMA購(gòu)于美國(guó)BD公司。PBS磷酸鹽緩沖液（粉劑）購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Ionomycin公司。Iomomycin購(gòu)于愛(ài)必信公司；儀器：A6流式細(xì)胞儀，37℃恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 小鼠免疫干預(yù)

1.2.1.1 Poly I:C對(duì)非特異性T細(xì)胞活化的影響 將6只體重相近的6～8周齡C57BL/6小鼠隨機(jī)分成兩組：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組小鼠腹腔注射200 μl PBS，實(shí)驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射50 μg Poly I:C（Poly I:C溶解于總量為200 μl的PBS中）。7天后分別處死各組小鼠，取得脾組織。

1.2.1.2 Poly I:C對(duì)特異性CD8+T細(xì)胞（OVA257-264）活化的影響 將12只體重相近的6～8周齡C57BL/6小鼠隨機(jī)分成四組：對(duì)照組、OVA肽組、Poly I:C組和OVA肽+Poly I:C組。對(duì)照組：小鼠腹腔注射200 μl PBS；OVA肽組：每只小鼠腹腔注射200 μg OVA肽（肽段溶解于總量為200 μl的PBS中）；Poly I:C組：每只小鼠腹腔注射100 μg Poly I:C（Poly I:C溶解于總量為200 μl的PBS中）；OVA肽+Poly I:C組：每只小鼠腹腔注射100 μg Poly I:C+200 μg OVA肽（溶解于總量為200 μl的PBS中）。7天后分別處死各組小鼠，取得脾組織。

1.2.2 T細(xì)胞刺激活化

研磨小鼠脾組織取得脾細(xì)胞混懸液，紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，300目濾網(wǎng)過(guò)濾，得到脾組織白細(xì)胞懸液；離心后重懸細(xì)胞，使其濃度為1×107個(gè)/毫升，接種于96孔板，每孔100 μl（1×106個(gè)細(xì)胞）。（1）研究非特異性T細(xì)胞：每孔加入PMA、Ionomycin刺激T細(xì)胞，PMA終濃度為50 ng/ml，Ionomycin終濃度為1 μg/ml；并加入golgi plug 4 微升/孔。96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育12 h。（2）研究特異性CD8+T細(xì)胞（OVA）活化：每孔加入OVA肽刺激脾細(xì)胞，OVA肽終濃度為10 μg/ml；并加入golgi plug 4微升/孔。96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育12 h。

1.2.3 細(xì)胞表面及胞內(nèi)染色

取上述刺激活化的T細(xì)胞，以CD3、CD8、CD4、PD-1等抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色；利用BD公司Cytofix/Cytoperm冰上避光孵育30 min，破細(xì)胞膜；加入IFN-γ-PE抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，冰上避光孵育30 min。染色后采用A6流式細(xì)胞儀與Flowjo 7.6.1軟件分析染色結(jié)果。IFN-γ+CD3+CD8+細(xì)胞即活化的CD8+T細(xì)胞；IFN-γ+CD3+CD4+細(xì)胞為活化的CD4+T細(xì)胞。

1.2.4 荷黑色素瘤小鼠免疫干預(yù)

取對(duì)數(shù)長(zhǎng)期B16F10細(xì)胞，接種在20只C57BL/6雌性小鼠的右背外側(cè)，每只接種5×105個(gè)B16F10細(xì)胞。10天后腫瘤生長(zhǎng)至肉眼可見(jiàn)時(shí)，將20只荷瘤小鼠隨機(jī)分成四組，分別為PBS組、CD8敲除組、Poly I:C組和Poly I:C +CD8敲除組。Poly I:C每隔5天腹腔注射一次，每只50微克/次，共注射3次。對(duì)照組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等體積PBS。CD8敲除抗體分別在Poly I:C注射前2天、前1天及Poly I:C注射5天后進(jìn)行腹腔注射，每只500微克/次。從第一次注射Poly I:C開(kāi)始，每3天記錄各組小鼠腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和與之垂直的短徑（W），并計(jì)算腫瘤體積（V=0.52×L×W2），當(dāng)對(duì)照組小鼠腫瘤體積超過(guò)4 000 mm3時(shí)終止荷瘤實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。t檢驗(yàn)、Two-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Poly I:C促進(jìn)小鼠非特異性T細(xì)胞活化

脾細(xì)胞經(jīng)PMA/Ionomycin刺激后，Poly I:C組活化的CD8+與CD4+T細(xì)胞百分比相對(duì)于對(duì)照組顯著升高，見(jiàn)表1、圖1A～B；Poly I:C組活化的CD8+與CD4+T細(xì)胞平均值也較對(duì)照組明顯增加，見(jiàn)表1、圖1C～D。

2.2 Poly I:C促進(jìn)特異性CD8+T細(xì)胞活化

取對(duì)照組、OVA肽組、Poly I:C組、OVA肽+Poly I:C組的脾細(xì)胞，加入OVA肽段刺激，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)IFN-γ染色檢測(cè)初次活化的OVA特異性CD8+T細(xì)胞數(shù)（IFN-γ+）。與Poly I:C組相比，OVA肽+Poly I:C組OVA特異性CD8+T顯著增加，見(jiàn)表2、圖2。

表1 PBS組與Poly I:C組活化的CD8+T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞及數(shù)量Table1 Number and percentage of activated CD8+T and CD4+T cells in PBS and Poly I:C groups

圖1 Poly I:C促進(jìn)PMA/ionomycin介導(dǎo)的非特異性T細(xì)胞活化Figure1 Poly I:C promoted PMA/ionomycin-mediated activation of nonspecific T cells

表2 Poly I:C對(duì)小鼠OVA特異性CD8+T細(xì)胞活化的影響Table2 Effects of Poly I:C on activation of OVA specific CD8+T cells

2.3 活化的特異性CD8+T細(xì)胞與非活化的CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)差異

取OVA肽+Poly I:C組的脾細(xì)胞，加入OVA肽段刺激，檢測(cè)初次活化的OVA特異性CD8+T細(xì)胞（IFN-γ+）與非活化的CD8+T細(xì)胞（IFN-γ-）表面PD-1表達(dá)差異。結(jié)果顯示：IFN-γ+CD8+T細(xì)胞高表達(dá)PD-1，見(jiàn)圖3。這一結(jié)果說(shuō)明在OVA肽+Poly I:C免疫后7天，還在脾組織內(nèi)，尚未向靶器官遷移的特異性CD8+T細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始表達(dá)PD-1。

2.4 Poly I:C顯著抑制小鼠黑色素瘤生長(zhǎng)

給予荷黑色素瘤小鼠PBS、CD8敲除、Poly I:C與CD8敲除、單用Poly I:C等方式干預(yù)，四組荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 17.116,P＜0.0001），見(jiàn)圖4。與對(duì)照組相比，Poly I:C組小鼠黑色素瘤生長(zhǎng)明顯減慢（F=7.8353,P=0.0243）；經(jīng)CD8敲除后，Poly I:C的抗腫瘤作用被明顯削弱（即Poly I:C+CD8敲除組vs.Poly I:C組：F=7.3425,P=0.0285）。

3 討論

PD-1信號(hào)在T細(xì)胞衰竭過(guò)程中發(fā)揮重要作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示：腫瘤組織中大多數(shù)T細(xì)胞都是衰竭型T細(xì)胞，無(wú)法合成IFN-γ；阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)，可以抑制T細(xì)胞衰竭，促進(jìn)部分腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞合成IFN-γ[7]；因此，PD-1是T細(xì)胞衰竭的標(biāo)志。然而,也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)可識(shí)別自身腫瘤抗原的T細(xì)胞都表達(dá)PD-1，指出PD-1表達(dá)是預(yù)示T細(xì)胞能產(chǎn)生抗腫瘤免疫的標(biāo)志[8-9]。考慮到PD-1表達(dá)可能具有不同效應(yīng)，非常有必要研究PD-1是在T細(xì)胞活化后的哪個(gè)階段開(kāi)始表達(dá)及該階段的T細(xì)胞功能。要解決上述問(wèn)題，首先需要活化T細(xì)胞，并探索PD-1表達(dá)與T細(xì)胞功能性分子IFN-γ之間的關(guān)系。

圖2 Poly I:C促進(jìn)OVA特異性CD8+T細(xì)胞活化Figure2 Poly I:C promoted activation of OVA specific CD8+T cells

病原微生物介導(dǎo)的宿主T細(xì)胞活化機(jī)制為解決這一問(wèn)題提供了新思路。當(dāng)機(jī)體遇到免疫原性強(qiáng)的病原體感染時(shí)，可以快速有效激活天然免疫系統(tǒng)，促進(jìn)特異性免疫應(yīng)答，這一過(guò)程中，病原體相關(guān)分子識(shí)別模式（PAMPs）發(fā)揮關(guān)鍵作用。PAMPs指病原微生物所含有的某些高度保守的分子，這些分子可以和吞噬細(xì)胞（如樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）表面的模式識(shí)別受體（PRR）結(jié)合，激活非特異免疫系統(tǒng)并提呈抗原，最終促進(jìn)T細(xì)胞活化。PRR包括甘露糖受體、清道夫受體、Toll樣受體（TLR）等；Poly I:C是TLR3配體，有研究報(bào)道Poly I:C可以促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)CD80、CD86[10-11]。由于抗原提呈細(xì)胞表面CD80/CD86可以與T細(xì)胞表面CD28結(jié)合并為T(mén)細(xì)胞活化提供第二信號(hào)，因此Poly I:C具有促進(jìn)T細(xì)胞活化的潛能，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)Poly I:C可以促進(jìn)脾臟內(nèi)特異性及非特異性T細(xì)胞活化。

我們的研究顯示Poly I:C免疫后7天，脾組織內(nèi)初次活化的特異性CD8+T細(xì)胞可以合成IFN-γ并高表達(dá)PD-1，且Poly I:C的抗腫瘤效應(yīng)和CD8+T細(xì)胞有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)說(shuō)明：（1）PD-1表達(dá)是早期事件，初次活化的、仍在外周淋巴器官內(nèi)未向靶器官遷移的CD8+T細(xì)胞就已經(jīng)開(kāi)始表達(dá)PD-1；（2）脾組織內(nèi)表達(dá)PD-1的CD8+T細(xì)胞是功能性的，可以合成IFN-γ，且Poly I:C的抗腫瘤效應(yīng)與活化的CD8+T細(xì)胞有關(guān)；（3）進(jìn)一步證實(shí)，在CD8+T細(xì)胞活化的不同階段，PD-1表達(dá)具有不同的效應(yīng)；外周淋巴器官內(nèi)可以合成IFN-γ的CD8+T細(xì)胞高表達(dá)PD-1，說(shuō)明PD-1也可以是T細(xì)胞的功能性標(biāo)志。

圖3 活化的OVA特異性CD8+T細(xì)胞(IFN-γ+)與非活化的CD8+T細(xì)胞(IFN-γ-)之間PD-1表達(dá)差異Figure3 Difference of PD-1 expression between activated OVA-specific CD8+T cells (IFN-γ+) and non-activated CD8+T cells (IFN-γ-)

圖4 Poly I:C顯著抑制荷黑色素瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)Figure4 Poly I:C significantly inhibited tumor growth of melanoma-bearing mice