朱青山，李軍擴(kuò)，劉維鵬，馬庭煒，代寧濤，馮連杰，魏濤，周福有

0 引言

中國(guó)北部處于被稱(chēng)為“食管癌地帶”的食管癌高發(fā)區(qū)[1]。尤其晉冀豫交界區(qū)，比世界低發(fā)區(qū)的發(fā)病率高出近60倍，食管癌仍居該地區(qū)惡性腫瘤發(fā)病的首位[2]。放射治療是食管癌非手術(shù)治療的主要手段[3]。晚期不能手術(shù)的食管癌常規(guī)單純放療的5年生存率為10%左右。近年來(lái)雖然放療手段和放療技術(shù)取得巨大進(jìn)步，但食管癌放療的總體生存率仍然沒(méi)有顯著提高[4]。臨床中經(jīng)常見(jiàn)到臨床分期相近的食管癌患者放療后療效存在明顯差異，這可能由于其基因突變譜的差異，使得相同病理類(lèi)型的腫瘤具有不同的臨床表型，同時(shí)對(duì)放療的療效存在顯著差異[5]。研究顯示放射抵抗是腫瘤局部復(fù)發(fā)、放療失敗的重要原因，各種信號(hào)通路在食管癌放射抵抗形成中起到重要作用[6]。如果能在治療前發(fā)現(xiàn)放射抵抗的基因類(lèi)型，從而預(yù)測(cè)出放療效果不佳的患者，逆轉(zhuǎn)放射抵抗，將能進(jìn)一步提高生存率?；蛐酒夹g(shù)可以一次性對(duì)樣品大量基因序列進(jìn)行檢測(cè)和分析，本研究即應(yīng)用基因芯片進(jìn)行全基因組CNV分析，篩查食管癌放射抵抗相關(guān)基因，為選擇合理的治療方案提供有力的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2013年12月—2016年8月在安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院行放射治療的食管癌患者66例，經(jīng)內(nèi)鏡活檢證實(shí)，病理類(lèi)型均為鱗狀細(xì)胞癌，臨床資料完整，男女不限，年齡不限，放射治療均采取三維適形調(diào)強(qiáng)（IMRT）放療技術(shù)。根據(jù)臨床療效分為兩組，放射敏感組：放射治療后達(dá)到臨床完全緩解并且持續(xù)一年以上（以下稱(chēng)S組）；放射抗拒組：放射治療未控，指放療無(wú)效或放療后半年內(nèi)放射野內(nèi)局部病變進(jìn)展（以下稱(chēng)R組）。每組各33例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因芯片CNV檢測(cè) 利用Affymetrix公司的OncoScan Array全基因組芯片檢測(cè)全基因組SNP及拷貝數(shù)變異（copy number variation, CNV）。以提取自福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixed and paraffin-embedded, FFPE）樣品的基因組 80 ng DNA為起始，采用分子倒置探針（molecular inversion probe, MIP）技術(shù)。比較基因組雜交（comparative genomic hybridization, CGH）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)熒光標(biāo)記。主要包括如下步驟：（1）從FFPE組織切片中提取基因組DNA、純化和電泳質(zhì)控，用Qubit方法定量，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整度。平均絕對(duì)百分偏差（MAPD）大于0.3的樣品認(rèn)為不合格；（2） FFPE 樣品的基因組 80 ng DNA為起始，待檢測(cè)DNA采用分子倒置探針技術(shù)在液相中進(jìn)行雜交、連接、第一次酶切、擴(kuò)增和第二次酶切反應(yīng)。分子倒置探針由7部分序列組成：2個(gè)內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，可用限制性?xún)?nèi)切酶切割，2段與目的基因互補(bǔ)的序列、2段通用引物序列以及 1 段特異性標(biāo)簽序列；（3）酶切后DNA進(jìn)行生物素標(biāo)記；（4）標(biāo)記DNA的特異性標(biāo)簽序列與芯片雜交；（5）芯片雜交、清洗、染色，染色完成后，將芯片放到掃描儀（GeneChip? Scanner 3000）掃描。

1.2.2 數(shù)據(jù)提取和分析 當(dāng)完成雜交和熒光標(biāo)記后，芯片的熒光掃描圖像被保存成DAT文件，AGCC軟件（Affymetrix? GeneChip?Command Console? Software）將DAT文件從圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)即CEL文件。CEL文件記錄探針?biāo)降臒晒庑盘?hào)強(qiáng)度值信息。OncoScan Console軟件將CEL文件的AT/GC兩通道合并，轉(zhuǎn)換成OSCHP文件，進(jìn)行數(shù)據(jù)提取?；贠SCHP文件，使用Nexus Express for OncoScan 3軟件進(jìn)行CNV和體細(xì)胞突變分析，采用TuScan算法。將獲得的生物學(xué)信息與參考基因組進(jìn)行覆蓋度的統(tǒng)計(jì)分析。檢測(cè)得到的變異結(jié)果與UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)、DBSNP數(shù)據(jù)庫(kù)、外顯子組測(cè)序計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)、分析。挑選出兩組的基因拷貝數(shù)差異及代表性基因。

1.2.3 驗(yàn)證分析 挑選出CNV差異顯著的片段，應(yīng)用Thermo Fisher 7500 qPCR儀對(duì)篩選出的CNV片段內(nèi)的代表基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。進(jìn)行DNA抽提、擴(kuò)增，擴(kuò)增階段進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，采取相對(duì)定量的2-ΔΔCt方法進(jìn)行基因表達(dá)分析。進(jìn)一步篩選出可能的目標(biāo)基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本資料的比較采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)量資料用（±s）表示，組間均數(shù)比較使用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 樣本質(zhì)量評(píng)價(jià)

利用Affymetrix平臺(tái)提取FFPE樣品的基因組DNA，然后用Qubit方法定量，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整度。先進(jìn)行20例DNA測(cè)序樣品電泳，13份質(zhì)檢合格，為兩組配比平衡，每組病例各挑選5例樣本，共10例進(jìn)行下一步基因芯片分析。納入檢測(cè)的10例樣本的臨床特征，見(jiàn)表1。食管癌的病變部位分段方法結(jié)合食管鋇餐、胃鏡和CT檢查，分段標(biāo)準(zhǔn)按UICC 1997公布的分段標(biāo)準(zhǔn)[7]。

表1 放射敏感組（S組）和放射抗拒組（R組）患者的一般臨床資料（例）Table1 Clinical data of radiosensitive (S) and radioresistant (R) groups (n)

2.2 芯片分析結(jié)果

對(duì)基因芯片檢測(cè)的全基因組拷貝數(shù)變異（CNV）數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，見(jiàn)圖1～2?？紤]樣品數(shù)目較少，兩組CNV差異比較的P值參考意義不大，我們挑選出兩組間CNV發(fā)生頻率之差≥40%，并且與已知CNV沒(méi)有重疊的 CNV片段做為本研究初步結(jié)果。共發(fā)現(xiàn)5個(gè)有意義 CNV片段，分別位于3、4、8、11、17號(hào)染色體，其中拷貝數(shù)缺失的（CN Loss）3個(gè)，增加的（CN Gain）1個(gè)，雜合性缺失的（LOH）1個(gè)。3p12.3 拷貝數(shù)缺失與17q11.2 LOH在放射抵抗組（R組）的發(fā)生頻率高于放射敏感組（S組），4p16.3、 11q23.3拷貝數(shù)缺失和8q23.3拷貝數(shù)增加在S組的發(fā)生頻率高于R組，見(jiàn)表2。

2.3 qPCR驗(yàn)證結(jié)果

在5個(gè)CNV差異有意義的片段內(nèi)，通過(guò)UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)分別挑選出5個(gè)可能的代表性基因，進(jìn)行qPCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。5個(gè)代表性基因分別為ROBO1、NSD2、CSMD3、CADM1、NF1。在S組和R組每組中各選取11例，共22例PPFE標(biāo)本。選取白蛋白（ALB）為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因引物序列為：F: ATGCTGCACAGAATCCTTGGT；R: TCATCGACTTCCAGAGCTGAAA。內(nèi)參基因和待測(cè)基因擴(kuò)增曲線(xiàn)平滑，溶解曲線(xiàn)單一，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，可用于后期分析。擴(kuò)增及溶解曲線(xiàn)見(jiàn)圖3～8。

圖2 10例食管癌樣本中拷貝數(shù)變異（CNV）的染色體G帶圖Figure2 Ideogram of CNV in Chromosome G band in 10 cases of ESCC samples

表2 放射敏感組（S組）和放射抵抗組（R組）患者的芯片分析結(jié)果Table2 Gene chip analysis results of radiosensitive (S) and radioresistant (R) groups

圖3 內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線(xiàn)及溶解曲線(xiàn)Figure3 Amplification and dissolution curves of reference genes

采用2-ΔΔCt作為評(píng)價(jià)基因水平的指標(biāo)，結(jié)果顯示基因ROBO1、NF1在兩組中的拷貝數(shù)無(wú)明顯差別。CSMD3雖然在S組中的拷貝數(shù)高于R組，但兩組表達(dá)均較低，沒(méi)有臨床意義。NSD2在R組中的拷貝數(shù)明顯高于S組。CADM1在兩組中的P值沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是絕對(duì)值相差比較大，可能有一定意義，見(jiàn)表3。

圖4 ROBO1基因擴(kuò)增曲線(xiàn)及溶解曲線(xiàn)Figure 4 Amplification and dissolution curves of ROBO1 gene

圖5 NSD2基因擴(kuò)增曲線(xiàn)及溶解曲線(xiàn)Figure5 Amplification and dissolution curves of NSD2 gene

3 討論

世界范圍內(nèi)，食管癌占癌癥死亡的第六位[8]。總體來(lái)講，食管癌預(yù)后遠(yuǎn)端好于近端。鱗癌比腺癌生存期要差[9]。我國(guó)食管癌人群中90%以上為食管鱗癌[10]。放射治療為非手術(shù)治療食管癌患者的根治性治療手段，但是與手術(shù)治療不同，頸段、胸上段食管癌患者放療后生存優(yōu)于胸中、下段食管癌患者[11]。

腫瘤放療敏感度是一個(gè)復(fù)雜而極具個(gè)體化的問(wèn)題。目前尚未得到量化指標(biāo)可準(zhǔn)確判斷食管癌患者對(duì)放療或放化療的敏感度。基因芯片具有高通量、高效率和高自動(dòng)化、高敏感度等優(yōu)點(diǎn)，成為分析基因表達(dá)模式的一種高效方法。OncoScanTM芯片采用分子倒置探針MIP技術(shù)，能夠?qū)FPE樣本進(jìn)行檢測(cè)，顯著提高了分辨率。

圖6 CSMD3基因擴(kuò)增曲線(xiàn)及溶解曲線(xiàn)Figure6 Amplification and dissolution curves of CSMD3 gene

圖7 CADM1基因擴(kuò)增曲線(xiàn)及溶解曲線(xiàn)Figure7 Amplification and dissolution curves of CADM1 gene

圖8 NF1基因擴(kuò)增曲線(xiàn)及溶解曲線(xiàn)Figure8 Amplification and dissolution curves of NF1 gen

表3 5個(gè)篩選基因的qPCR結(jié)果 (±s,n=10)Table3 qPCR results of five genes (±s, n=10)

表3 5個(gè)篩選基因的qPCR結(jié)果 (±s,n=10)Table3 qPCR results of five genes (±s, n=10)

?

本研究采用基因芯片初步探討了與食管癌放療敏感度相關(guān)的分子事件，篩選出可能對(duì)食管癌放射敏感度預(yù)測(cè)價(jià)值最大的5個(gè)基因拷貝數(shù)變異（CNV）區(qū)域，并針對(duì)這5個(gè)區(qū)域內(nèi)的代表性基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)4p16.39（代表性基因NSD2）和11q23.3（代表性基因CADM1）的拷貝數(shù)缺失（Loss）發(fā)生率在放射抵抗組（R組）中明顯高于放射敏感組（S組）。我們認(rèn)為NSD2和CADM1可能是與食管癌放射抵抗的相關(guān)位點(diǎn)，其機(jī)制有待更多的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

NSD2位于染色體4p16.3上，主要功能是參與組蛋白的甲基化修飾。沉默NSD2會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)DNA損傷劑如羥基脲，喜樹(shù)堿和絲裂霉素C以及電離輻射的敏感度增加。NSD2調(diào)節(jié)DNA修復(fù)基因的表達(dá)[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)在放療抗拒組中有高水平的NSD2表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道的一致。進(jìn)一步研究NSD2甲基轉(zhuǎn)移酶類(lèi)的藥物開(kāi)發(fā)，將有可能逆轉(zhuǎn)腫瘤的放射抵抗。

CADM1稱(chēng)細(xì)胞黏附分子1（cell adhesion molecule 1, CADM1），研究報(bào)道的免疫組織化學(xué)的檢測(cè)結(jié)果顯示，與ESCC組織相比，CADM1 mRNA表達(dá)在正常組織中高度上調(diào)，表明CADM1表達(dá)的喪失影響ESCC的發(fā)病機(jī)制，侵襲和轉(zhuǎn)移以及預(yù)后[15-16]。其詳細(xì)機(jī)制需進(jìn)一步研究。

這些研究結(jié)果提示食管癌對(duì)放射線(xiàn)產(chǎn)生放射抵抗是復(fù)雜的多基因共同作用的結(jié)果，以上2個(gè)基因涉及DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞黏附等與治療敏感度相關(guān)的重要分子生物學(xué)通路。只有通過(guò)對(duì)基因表觀遺傳的全面分析才有可能全面解釋食管癌復(fù)雜的放射抵抗機(jī)制，為提高食管癌放射治療的敏感度提供新的靶點(diǎn)及策略。

本研究中樣本例數(shù)相對(duì)較少，統(tǒng)計(jì)學(xué)上篩選兩組差異基因存在假陽(yáng)性率大的缺點(diǎn)。同時(shí)本研究?jī)山M的臨床特征并不完全相同，是因?yàn)楸狙芯渴歉鶕?jù)臨床無(wú)進(jìn)展生存期的長(zhǎng)短選擇的病例，臨床分期和病變分段沒(méi)有嚴(yán)格限制，也可能會(huì)造成結(jié)果的偏倚。下一步一方面需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行分層深入研究，另一方面需要進(jìn)一步進(jìn)行免疫組織化學(xué)驗(yàn)證蛋白層面的表達(dá)。