陳 琳，甘 露，周紅艷，梁江紅

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是當(dāng)前臨床常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，目前臨床上針對(duì)該病主要的治療方法包括手術(shù)、藥物以及基因治療等[1]。隨著干細(xì)胞技術(shù)的成熟和發(fā)展，干細(xì)胞移植治療有望成為PD治療的重要手段[2]。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞 (human amnion-derived mesenchymalstem cells, hAD-MSCs) 具有多向分化潛能，體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，移植后細(xì)胞能存活，可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞[3]。核相關(guān)受體因子1(nuclear receptor related factor 1,Nurr1)基因是屬于核受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子，主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在中腦黑質(zhì)海馬、小腦、下丘腦后部等均呈現(xiàn)高表達(dá)[4]。該研究將hAD-MSCs移植和Nurr1基因結(jié)合起來進(jìn)行研究，探討過表達(dá)Nurr1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)PD大鼠黑質(zhì)紋狀體的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞鑒定人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞hAD-MSCs購自北京裕恒豐科技有限公司，將hAD-MSCs經(jīng)0.05%胰蛋白酶消化后，使用1% BSA調(diào)整細(xì)胞濃度在1×106/ml加入熒光標(biāo)記抗體(CD29-PE、CD44-PE、CD-34-PE)于150 μl細(xì)胞懸液避光孵育0.5 h，隨后加入2 ml含1 g/L疊氮化鈉(NaN3)的PBS，振蕩混勻后，1 000 r/min離心5 min，棄上清并加入10 g/L多聚甲醛200 μl混勻，5 min內(nèi)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，使用Cell Quest軟件分析。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染在國家生物技術(shù)中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的Gene庫查閱大鼠Nurr 1基因(別名：Nr4a2，Gene ID：54278)并獲取其編碼序列。真核表達(dá)載體(pcDNA3.1-Nurr1)及陰性對(duì)照載體(pcDNA3.1-Negative control)均由美國賽默飛世爾公司完成。質(zhì)粒小量制備試劑盒(PLN350-1KT，美國Sigma公司)提取pcDNA3.1-Nurr1載體。使用lipofectamine試劑盒(11668019，美國Invitrogen公司)將上述載體轉(zhuǎn)染至傳代后的hAD-MSCs，轉(zhuǎn)染后24 h加入新霉素使培養(yǎng)基終濃度為300 μg/ml。

1.3細(xì)胞移植及分組20只雄性PD模型Sprague-Dawley大鼠及10只雄性正常Sprague-Dawley大鼠購自北京瑞金特生物科技有限公司，質(zhì)量在180～220 g。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，濕度50%～60%；光照12 h，黑暗12 h。20只PD大鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組和Nurr1組，每組各10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后，用微量注射器將含有約2×105個(gè)hAD-MSCs(含pcDNA3.1-N urr1或pcDNA3.1-Negative control質(zhì)粒)的DMEM 5 μl移植到Nurr1組小鼠右側(cè)紋狀體，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒。另選10只正常Sprague-Dawley大鼠作為生理鹽水組，于相同部位注射等量的生理鹽水。

1.4旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)三組大鼠分別在分組后第4、8、12天上午9點(diǎn)在直徑為40 cm的不銹鋼盆中觀察記錄大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)與持續(xù)時(shí)間。

1.5qRT-PCR總RNA提取試劑盒購自美國Promega公司，大鼠黑質(zhì)紋狀體總RNA提取依照試劑盒說明書進(jìn)行，以cDNA為模板，采用miScript SYBR Green PCR Kit(218073，德國QIAGEN公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，PCR反應(yīng)序列見表1。利用2-ΔΔCt法檢測(cè)大鼠黑質(zhì)紋狀體中各基因mRNA表達(dá)水平。2-ΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，其中ΔCt為目的基因和內(nèi)參照基因Ct值的差值。

表1 qRT-PCR引物

1.6Westernblot所有抗體購自英國Abcam公司。提取細(xì)胞總蛋白并依據(jù)BCA試劑盒說明書對(duì)蛋白進(jìn)行定量。取20 μl總蛋白并電泳、轉(zhuǎn)膜并且封閉后在 37 ℃下輕搖2 h后分別加入一抗Nurr1、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transporter，DAT)、α-突觸共核蛋白(α synuclein,α-syn)進(jìn)行孵育。于4 ℃輕搖過夜后，用TBST洗膜3次，每次5 min，以β-actin作為對(duì)照。洗膜結(jié)束后加入二抗IgG于37 ℃下孵育1.5 h后用TBST洗膜3次，每次5 min。ECL顯影，曝光，用Quantity One軟件進(jìn)行半定量分析，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7免疫組化取-80 ℃冰箱保存的黑質(zhì)紋狀體于4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定，置于20% 蔗糖溶液(4 ℃)中過夜，蠟塊制作切片，脫臘。切片滴加2滴3% H2O2室溫孵育10 min，PBS洗滌3次，每次3 min；隨后滴加一抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)室溫孵育2 h，PBS洗滌5次,每次3 min；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)IgG室溫孵育30 min，PBS洗滌5次，每次3 min。50 μl DAB于25 ℃顯色5 min，隨后蘇木精復(fù)染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后高倍鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)陽性染色面積率。

1.8HE染色將黑質(zhì)紋狀體切片使用二甲苯脫臘20 min，梯度濃度酒精(100%、95%、80%、75%)脫水1 min，蒸餾水洗2 min，蘇木精染色10 min，蒸餾水沖洗反藍(lán)，鹽酸乙醇分化30 s，50 ℃溫水浸泡5 min，伊紅染色30 s后蒸餾水洗去背景紅色。隨后70%和90%酒精脫水各10 min，二甲苯透明，中性樹膠封片，高倍鏡下觀察組織形態(tài)。

1.9Tunel染色制備好的黑質(zhì)紋狀體切片二甲苯浸洗2次，每次5 min，梯度酒精脫水(100%、95%、80%、75%)各3 min，PBS洗滌3次，每次5 min；20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K工作液處理組織15～30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，烘干；玻片滴加50 μl Tunel反應(yīng)液于37 ℃反應(yīng)60 min，PBS洗滌3次，每次5 min，50 μl DAB于25 ℃顯色10 min， PBS洗滌3次，每次5 min。蘇木精復(fù)染，自來水沖洗3次，每次5 min。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間數(shù)據(jù)分析使用T檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞鑒定結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測(cè)含有表面抗原CD29、CD44和CD34的hAD-MSCs數(shù)目：hAD-MSCs中高表達(dá)CD29和CD44但幾乎不表達(dá)CD34。見圖1。

2.2過表達(dá)Nurr1的hAD-MSCs移植改善PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為對(duì)各組大鼠進(jìn)行旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)：與生理鹽水組各時(shí)間段相比，其余組大鼠在各時(shí)間段旋轉(zhuǎn)次數(shù)及持續(xù)時(shí)間顯著減少。與陰性對(duì)照組相比，Nurr1組旋轉(zhuǎn)次數(shù)和持續(xù)時(shí)間在移植后第4天無顯著差異，但在第8天和第12天上述指標(biāo)顯著減少(P<0.05)。見表2、3。

2.3Nurr1過表達(dá)上調(diào)黑質(zhì)紋狀體DAT但下調(diào)α-synqRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果：與生理鹽水組相比，其余組大鼠Nurr1、DAT mRNA及蛋白表達(dá)均降低，但α-syn表達(dá)上調(diào)。與陰性對(duì)照組相比， Nurr1組Nurr1和DAT表達(dá)上調(diào)但α-syn表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見圖2。

圖1 CD29、CD44和CD34在hAD-MSCs中表達(dá)

圖2 大鼠黑質(zhì)紋狀體Nurr1、DAT和α-syn的表達(dá)

2.4Nurr1過表達(dá)上調(diào)黑質(zhì)紋狀體TH表達(dá)免疫組化檢測(cè)結(jié)果：TH存在于黑質(zhì)紋狀體組織的胞質(zhì)與胞核，其陽性細(xì)胞胞體較大，多神經(jīng)元突起。與生理鹽水組相比，其余組大鼠TH表達(dá)顯著降低。與陰性對(duì)照組相比，過表達(dá)Nurr1能促進(jìn)TH上調(diào)。見圖3。

2.5Nurr1過表達(dá)有助于改善黑質(zhì)紋狀體病理形態(tài)HE染色觀察各組大鼠黑質(zhì)紋狀體病理特征：生理鹽水組及神經(jīng)元數(shù)目較密，排列整齊有序，間質(zhì)清晰；陰性對(duì)照組神經(jīng)元排列紊亂、數(shù)目減少、胞體輪廓模糊，胞質(zhì)腫脹，部分空泡變性或皺縮壞死。但Nurr1組上述情況較為改善。見圖4。

2.6Nurr1過表達(dá)減少黑質(zhì)紋狀體細(xì)胞凋亡Tunel染色檢測(cè)各組大鼠黑質(zhì)紋狀體細(xì)胞凋亡情況：與生理鹽水組相比，其余組細(xì)胞凋亡率顯著升高。與陰性對(duì)照組相比，過表達(dá)Nurr1能減少黑質(zhì)紋狀體細(xì)胞凋亡。見圖5。

3 討論

PD作為老年中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要是由于中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)元變性死亡進(jìn)而導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體中DA含量顯著減少而引起的[5]。目前常見的手術(shù)和藥物治療僅僅能夠起到緩解PD癥狀的作用，難以有效延緩病程、改善腦內(nèi)DA含量并且保護(hù)DA能神經(jīng)元[6]。基因治療以及干細(xì)胞移植方法的出現(xiàn)為該病的治療提供了良好的方法。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[7]證實(shí)hAD-MSCs能改善PD模型動(dòng)物的癥狀，但因涉及復(fù)雜的重編程技術(shù)，且存在誘導(dǎo)效率低，其實(shí)際應(yīng)用還有較大障礙?；蛑委熤饕峭ㄟ^基因或病毒載體轉(zhuǎn)染于病變部位進(jìn)而實(shí)現(xiàn)治療的目的[8]。有研究[9]證實(shí)將外源性的TH基因?qū)隤D模型大鼠紋狀體內(nèi)可增加腦內(nèi)DA的水平。Nurr1基因在中腦DA能神經(jīng)元的發(fā)育過程中具有重要意義，Nurr1基因缺乏能夠?qū)е麓笫竽X黑質(zhì)DA能神經(jīng)元顯著降低[10]。有研究[11]將Nurr1基因修飾的細(xì)胞移植于PD大鼠腦中發(fā)現(xiàn)大鼠紋狀體內(nèi)DA含量顯著升高，但進(jìn)一步研究卻發(fā)現(xiàn)僅僅是Nurr1基因難以對(duì)大鼠DA水平及其癥狀進(jìn)行長期改善。本研究將hAD-MSCs移植和Nurr1基因結(jié)合起來進(jìn)行研究，顯示過表達(dá)Nurr1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)PD大鼠黑質(zhì)紋狀體具有明顯保護(hù)作用。

表2 各組大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)

與生理鹽水組比較：*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較：#P<0.05

表3 各組大鼠旋轉(zhuǎn)持續(xù)時(shí)間

與生理鹽水組比較：*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較：#P<0.05

圖3 免疫組化檢測(cè)大鼠黑質(zhì)紋狀體TH表達(dá) × 400

圖4 HE染色觀察大鼠黑質(zhì)紋狀體病理情況 × 200

圖5 Tunel染色檢測(cè)大鼠黑質(zhì)紋狀體細(xì)胞凋亡 × 400

本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞儀檢測(cè)含有表面抗原CD29、CD44和CD34的HAMSCs數(shù)目顯示，HAMSCs中高表達(dá)CD29和CD44等間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志，但幾乎不表達(dá)作為造血干細(xì)胞標(biāo)志的CD34。進(jìn)一步證實(shí)了HAMSCs具有干細(xì)胞特性。尚玉攀 等[12]在研究中也證實(shí)了這一點(diǎn)。對(duì)各組大鼠進(jìn)行旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Nurr1組相對(duì)于陰性對(duì)照組來說其在第8天和第12天時(shí)各時(shí)間段旋轉(zhuǎn)次數(shù)及持續(xù)時(shí)間顯著減少。證實(shí)過表達(dá)Nurr1的HAMSCs移植能夠改善PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為。中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元丟失進(jìn)而引起的DAT水平降低是導(dǎo)致PD發(fā)病的重要原因，研究[13]證實(shí)，PD、阿爾茨海默病以及多系統(tǒng)萎縮等疾病的發(fā)病與突觸核蛋白表達(dá)異常存在密切關(guān)聯(lián)，也被稱為突觸核蛋白病。α-syn作為路易小體的重要組成，其異常表達(dá)是引起以上疾病發(fā)病的重要原因[14]。而本研究表明，Nurr1過表達(dá)能夠上調(diào)黑質(zhì)紋狀體DAT，同時(shí)促進(jìn)α-syn水平的下調(diào)，這也進(jìn)一步證實(shí)了其在改善PD中的重要作用。TH是人腦內(nèi)關(guān)鍵DA遞質(zhì)通路，在DA的合成中起著重要作用[15]。免疫組化結(jié)果顯示，過表達(dá)Nurr1能夠顯著促進(jìn)TH的上調(diào)，減輕對(duì)于大鼠黑質(zhì)紋狀體DA能神經(jīng)元的損傷。HE染色和Tunel染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),Nurr1過表達(dá)能夠顯著改善大鼠黑質(zhì)紋狀體病理形態(tài)、減少其細(xì)胞凋亡情況。

本研究首次將Nurr1過表達(dá)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞用于PD大鼠的治療，結(jié)果顯示，該方法能夠顯著改善大鼠病理癥狀，提高黑質(zhì)紋狀體DAT及TH含量，對(duì)于PD的治療提供了新的思路。今后本研究會(huì)深入關(guān)注Nurr1過表達(dá)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于大鼠黑質(zhì)紋狀體保護(hù)作用的具體機(jī)制。