庹 鵬， 陳偉明， 劉先保， 吳亞芬， 黃夢婷， 陳曉彤， 王壽平△

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉科， 廣東 廣州 510150； 2中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院博濟(jì)醫(yī)療中心， 廣東 廣州 510120)

膿毒癥相關(guān)腦病(sepsis-associated encephalopathy，SAE)是指大腦在無直接感染的臨床證據(jù)前提下，因全身感染引起的彌漫性或多灶性腦功能障礙，臨床表現(xiàn)主要為情緒不穩(wěn)定、定向障礙和學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙等，是ICU患者發(fā)生腦病的主要形式[1]。此病非由腦出血、顱內(nèi)感染和肺臟感染等其它引起的相關(guān)性腦病，其確切發(fā)病機(jī)制也尚未明確，是臨床醫(yī)學(xué)的突出難題[2-3]。有研究表明，對于由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘發(fā)的膿毒癥腦病老年小鼠，抑制炎癥通路TLR4/NF-κB下游靶點(diǎn)可改善認(rèn)知功能[4]。TAK-242作為 Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)的特異性拮抗劑，目前已被證實(shí)可以透過血腦屏障，在缺血-再灌注損傷和腦中風(fēng)等動物模型中能有效降低炎癥因子的釋放，從而對腦組織起保護(hù)作用[5]。本研究擬探討TAK-242對膿毒癥腦病小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的改善效應(yīng)并探究其可能的作用機(jī)制，為臨床治療膿毒癥腦病提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗動物

80只健康雌性SPF級C57BL/6小鼠，質(zhì)量20～30 g，10～12月齡，均由廣東省實(shí)驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2013-0002。所有小鼠實(shí)驗前進(jìn)行1周的檢疫，飼養(yǎng)于12 h/12 h的明暗周期環(huán)境中，溫度20 ℃～25 ℃，濕度20%～30%，動物可自由活動，按時提供飼料和飲用水。所有的實(shí)驗經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心倫理委員會批準(zhǔn)，按照廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心實(shí)驗指南進(jìn)行。

2 主要儀器

離心機(jī)(Sigma)；微量血?dú)夥治鰞x(雅培i-STAT 1)；Image-Pro Plus多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)(Media Cybernetics)；酶標(biāo)儀、蛋白電泳儀和蛋白凝膠成像掃描儀(Bio-Rad)。

3 主要試劑

TAK-242(MCE)；脂多糖(大腸桿菌來源，25MG，批號L2880，Sigma)；BCA蛋白定量試劑盒(KGA801)和ECL化學(xué)發(fā)光液(KGP1123)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；抗離子鈣結(jié)合銜接分子1(ionized calcium-binding adapter molecule-1,Iba-1)兔單克隆抗體(貨號ab178847)、抗NF-κB p65兔多克隆抗體(貨號ab16502)、抗TLR4兔多克隆抗體(貨號ab13556)、抗Aβ1-42兔單克隆抗體(貨號ab201060)和抗p-tau (S396)兔單克隆抗體(貨號ab109390)購自Abcam。

4 方法

4.1動物模型制作及分組 健康雌性C57BL/6小鼠80只，用隨機(jī)數(shù)字法將其平均分為空白對照(control，CON)組、TAK-242對照組(TAK組)、膿毒癥腦病模型組(LPS組)和TAK-242預(yù)處理組(T+L組)。參照文獻(xiàn)[6]，LPS組腹腔注射250 μg/kg LPS，每天1次，持續(xù)7 d； T+L組則每天在注射LPS前30 min按5 mg/kg腹腔注射TAK-242，持續(xù)7 d。CON組和TAK組分別每天注射等量的0.9%生理鹽水和TAK-242 1次，持續(xù) 7 d。造模完成后，隨機(jī)選取各組小鼠(n=4)采集左心室血進(jìn)行血?dú)夥治?取肺組織進(jìn)行HE染色。

4.2行為學(xué)實(shí)驗 曠場實(shí)驗(open-field test, OFT)、高架十字實(shí)驗(elevated plus-maze test, EPMT)和水迷宮實(shí)驗(water maze test,WMT)均在暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院完成。(1)曠場實(shí)驗在安靜的房間中進(jìn)行，敞箱設(shè)備由不透明材料制成，底面為50 cm×50 cm正方形，邊緣墻高50 cm，定義中央?yún)^(qū)25 cm×25 cm，將小鼠放入敞箱中央，使之自由活動5 min，使用Ethovision XT8系統(tǒng)相機(jī)記錄小鼠活動情況，記錄進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)和中央?yún)^(qū)停留的時間，每次結(jié)束后，用75%乙醇清理小鼠排泄物，盡量減少小鼠殘留氣味，待乙醇揮干后，再進(jìn)行下一只小鼠實(shí)驗。(2)高架十字迷宮為長100 cm×寬12 cm的塑料十字架，離地面高50 cm,高架分為3部分，中央?yún)^(qū)12 cm×12 cm,開臂區(qū)和閉臂區(qū)均為44 cm×12 cm，開臂邊緣外5 cm定義為點(diǎn)頭區(qū)，正式實(shí)驗時，將小鼠置于中央?yún)^(qū)，頭面向開放臂，實(shí)驗者迅速離開，通過錄像系統(tǒng)，記錄小鼠的活動情況，檢測其進(jìn)入開放臂次數(shù)和開放臂停留時間，進(jìn)入點(diǎn)頭區(qū)次數(shù)及在點(diǎn)頭區(qū)停留時間。總時間5 min，結(jié)束后用75%乙醇清洗再進(jìn)入下一只小鼠實(shí)驗。(3)Morris水迷宮為直徑120 cm、高100 cm的圓柱形水缸，平臺高度為30 cm，直徑為10 cm，平臺在水下1 cm，水缸分為4個象限，在水缸壁四周不同位置標(biāo)記有不同的幾何圖形以供小鼠觀察定位。造模結(jié)束后，所有動物正式開始前按組別依次入水讓其自由游泳1 min。30 min后正式實(shí)驗，水溫保持25 ℃，頭4 d先進(jìn)行定位航行(place navigation)實(shí)驗，第5天開始空間探索(spatial probe)實(shí)驗，撤去平臺，從平臺象限的對側(cè)入水，每只小鼠持續(xù)1 min，檢測其逃避潛伏期(escape latency)。

4.3小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)病理學(xué)檢查 取行為學(xué)實(shí)驗后每組小鼠隨機(jī)選取8只，使用10%水合氯醛麻醉，按照4 mL/kg劑量麻醉，0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛依次各灌注10分鐘，后取出大腦進(jìn)行內(nèi)固定48 h，固定完成后，PBS清洗3次，每次2 h，然后用梯度乙醇脫水，并將腦組織浸泡于二甲苯中透明處理，處理30 min，然后取出腦組織并用濾紙吸凈表面二甲苯。使用石蠟對腦組織進(jìn)行浸滲處理，將預(yù)熱好的石蠟過濾，并將腦組織浸泡于石蠟中，在恒溫箱中浸滲60 min，最后將石蠟與組織倒入蠟槽中，自然冷卻，在石蠟切片機(jī)中進(jìn)行切片，以正常組小鼠大腦組織石蠟切片，標(biāo)注海馬CA1、CA3和齒狀回(dentate gyrus,DG)區(qū)域，見圖1。取出小鼠大腦石蠟切片，使用二甲苯脫臘，然后用梯度濃度的乙醇進(jìn)行復(fù)水處理，浸泡于蒸餾水中待用。每塊腦切片使用50 μL 3%過氧化氫溶液室溫下孵育10 min，PBST沖洗3次，每次5 min。取500 mL EDTA抗原修復(fù)液，加熱至微沸，將腦組織緩慢放入燒杯中，保持微沸20 min，室溫下取出冷卻，PBST清洗3次，每次5 min。去除PBST液，加入已稀釋的(1 ∶1 000) I抗50 μL，4 °C過夜18h，去除 I抗，PBST清洗3次，每次5 min，去除PBST液，每張切片加入50 μL II抗，37 ℃孵育60 min，PBST沖洗3次，每次5 min，去除PBST液，加入50 μL新鮮配置的DAB溶液，顯色3 min，用蒸餾水沖洗，使用蘇木素染色10 min，蒸餾水沖洗，加入0.1%鹽酸進(jìn)行分化，使用PBS進(jìn)行返藍(lán)，最后中性樹脂封片。每組選取相應(yīng)的海馬組織，參照小鼠大腦圖譜，采用多功能彩色細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)，在20倍光鏡下觀察海馬CA1、CA3及DG區(qū)域陽性細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

Figure 1.Distribution of different parts of hippocampus in normal mouse brain (×20).

圖1正常小鼠腦組織海馬不同部位的分布

4.4Western blot測定小鼠體內(nèi)中樞神經(jīng)炎癥通路相關(guān)蛋白 取每組剩余的8只小鼠，使用10%水合氯醛麻醉，按照4 mL/kg劑量麻醉，取海馬組織，使用4 ℃的PBS清洗腦組織3次，用濾紙吸干液體后，稱重，在冰上加入裂解液勻漿，勻漿液在室溫靜置30 min，在4 ℃、15 000 r/min離心1 h，取上清，分裝,采用BCA法測定蛋白濃度。取蛋白樣品溶液，取總蛋白30 μg，進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后用5%的脫脂奶粉封閉液常溫?fù)u床振蕩孵育2 h，加入I抗(濃度均為1∶1 000)4 ℃孵育過夜，次日用TBST洗膜3次,每次5 min。加入HRP標(biāo)記的 II 抗(1∶5 000)，常溫振蕩孵育1 h。TBST洗膜5次，每次5 min。將ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，曝光，所得條帶用ImageJ軟件分析灰度值。

5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠造模情況分析

與CON組相比，其余各組小鼠動脈血?dú)夥治鑫窗l(fā)生明顯變化，見表1；肺臟病理切片HE染色結(jié)果也未發(fā)生明顯炎癥病變,見圖2。

表1 各組小鼠動脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果

Figure 2.Pathological observation of lung tissues with HE staining in each group (×200).

圖2HE染色觀察肺臟病理情況

2 各組小鼠行為學(xué)的變化

2.1曠場實(shí)驗 與CON組相比，LPS組的中央?yún)^(qū)活動時間和穿過中央?yún)^(qū)次數(shù)都顯著降低(P<0.01)；與LPS組相比，T+L組的中央?yún)^(qū)活動時間及穿過中央?yún)^(qū)次數(shù)顯著增加(P<0.01)，TAK組與CON組比較沒有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，見表2。

表2 各組小鼠在曠場實(shí)驗中的活動情況

**P<0.01vsCON group;##P<0.01vsLPS group.

2.2高架十字實(shí)驗 與CON組相比，LPS組的開臂進(jìn)入次數(shù)和點(diǎn)頭區(qū)進(jìn)入次數(shù)均明顯減少(P<0.05)，與LPS組相比，T+L組的開臂進(jìn)入次數(shù)和點(diǎn)頭區(qū)進(jìn)入次數(shù)顯著增加(P<0.05)，TAK組與CON組比較沒有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，見表3。

2.3Morris水迷宮實(shí)驗 在第1～2天訓(xùn)練定位航行中，各組到達(dá)平臺區(qū)所用時間無顯著差異，在第3～4天的訓(xùn)練中，與CON組相比，LPS組小鼠找到目標(biāo)平臺區(qū)的逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)；與LPS組相比，T+L組在第4天的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)。第5天撤去平臺的空間探索中，與CON組相比，LPS組小鼠找到目標(biāo)平臺區(qū)的逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)；與LPS組相比，T+L組的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)；TAK組與CON組比較沒有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，見表4。

3 小鼠大腦組織海馬區(qū)的免疫組化染色觀察

與CON相比，LPS組小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物Iba-1陽性細(xì)胞(尤其是CA1、CA3與DG區(qū))數(shù)量增多，胞體變大，呈分枝狀；TAK組結(jié)果與CON組基本一致，提示TAK-242對正常海馬組織沒有明顯損傷作用；與LPS組相比，T+L組海馬CA1、CA3與DG 區(qū)Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，見圖3。這一結(jié)果提示腹腔預(yù)防性注射TAK-242可減輕由LPS造成的小鼠海馬損傷。

*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsLPS group.

表4 各組小鼠在Morris水迷宮實(shí)驗中的活動情況

*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsLPS group.

4 Western blot實(shí)驗結(jié)果分析

在CON組及TAK組中，小鼠腦內(nèi)的中樞神經(jīng)炎癥相關(guān)蛋白NF-κB p65、TLR4、Aβ1-42和p-tau(S396)的表達(dá)均較低，無顯著差異；與CON組相比，LPS組小鼠腦內(nèi)中樞神經(jīng)炎癥相關(guān)蛋白顯著上調(diào)(P<0.01)；與LPS組相比,T+L組的NF-κB p65、TLR4、Aβ1-42和p-tau (S396)表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，表明TAK-242在5 mg/kg的給藥濃度下，可顯著降低小鼠腦內(nèi)中樞炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，見圖4。

討 論

膿毒癥是危重癥患者中的常見并發(fā)癥，具有發(fā)病率高，死亡率高的特點(diǎn)，確切機(jī)制尚不明確。膿毒癥引起的認(rèn)知功能障礙與中樞神經(jīng)炎癥關(guān)系密切，中樞神經(jīng)炎癥是導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的重要原因[7]，理想的動物疾病模型是人們研究疾病發(fā)病機(jī)制和防治的基礎(chǔ)，因此建立合理的動物疾病模型相當(dāng)重要。

LPS是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的經(jīng)典藥物，其小鼠模型具有對全身功能影響小、對行為學(xué)研究干擾小、易操作和死亡率低等優(yōu)點(diǎn)，少量多次持續(xù)注射LPS能很好地模擬人體感染病灶緩慢持續(xù)釋放細(xì)菌或毒素入血的特征，可使宿主有充分的時間啟動免疫炎癥反應(yīng)，通過動脈血?dú)夥治鲆约胺尾坎±砬衅瑱z測，排除肺部明顯炎癥，為中樞神經(jīng)炎癥研究的可靠模型[8]，因此本研究參照文獻(xiàn)，連續(xù)7 d腹腔注射LPS 250 μg可成功誘發(fā)外周感染模型。

曠場實(shí)驗和高架十字實(shí)驗是評價小鼠探索功能以及焦慮和恐懼情緒的經(jīng)典方法, 小鼠在焦慮恐懼狀態(tài)下會表現(xiàn)出特有的呆滯狀態(tài)，探索行為減少。本研究結(jié)果顯示， LPS引起的膿毒癥腦病小鼠穿越曠場中央?yún)^(qū)、高架十字的開臂區(qū)和點(diǎn)頭區(qū)的時間和次數(shù)減少；此外， Morris水迷宮實(shí)驗評價小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能，結(jié)果顯示，膿毒癥腦病小鼠逃避潛伏期延長，而通過TAK-242干預(yù)后，小鼠的焦慮情況和學(xué)習(xí)記憶功能也有所改善。

海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要結(jié)構(gòu)，海馬區(qū)炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致膿毒癥腦病認(rèn)知障礙的主要病理生理之一，其作用機(jī)制是LPS可與中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞表面TLR4受體結(jié)合，激活并釋放大量炎癥因子，導(dǎo)致海馬組織損傷，從而影響其記憶形成與維持功能[9-10]。通過觀測LPS組小鼠海馬區(qū)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目及密度均增加，呈分枝狀，突起變短，細(xì)胞數(shù)量減少。免疫組化海馬區(qū)Iba-1陽性細(xì)胞進(jìn)一步揭示了LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能的障礙[11]。

NF-κB是廣泛存在于細(xì)胞中的凋亡相關(guān)因子，是細(xì)胞核重要的轉(zhuǎn)錄因子，p65是NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子的核心亞基,參與機(jī)體的免疫、炎癥和組織損傷修復(fù)等，同時還會調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。細(xì)胞外的LPS、TNF-α和IL-1β等可激活NF-κB，并激活其下游一系列蛋白，最終使細(xì)胞通過線粒體途徑凋亡。

Figure 3.Immunohistochemical staining of Iba-1 in the hippocampus of the mice.The arrows indicate active microglia.Mean±SD.n=8.**P<0.01vsCON group;#P<0.05vsLPS group.

圖3小鼠大腦海馬Iba-1免疫組化染色情況

TLR4信號通路是免疫系統(tǒng)中的重要炎癥通路之一，是各類炎癥的重要靶點(diǎn)，可被LPS中的脂質(zhì)A部分激活，因此常用作炎癥反應(yīng)模型制作的重要指標(biāo)[12]。Aβ1-42是Aβ蛋白家族中的一種亞型，是神經(jīng)中樞中小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的激活蛋白，并可通過異常磷酸化大量累積而影響患者認(rèn)知功能。在正常生理狀態(tài)下，Aβ1-42蛋白濃度極低，但在神經(jīng)炎癥刺激狀態(tài)下，Aβ蛋白大量產(chǎn)生，并轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘摩抡郫B結(jié)構(gòu)，在組織中大量沉積，促使小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)及炎癥因子，加劇中樞神經(jīng)炎癥的發(fā)展，因此其表達(dá)水平可從一定程度反映患者認(rèn)知功能損傷水平[13]。本實(shí)驗中，通過腹腔注射LPS，其通過血液循環(huán)透過血腦屏障，可直接與神經(jīng)中樞中的小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4相結(jié)合，導(dǎo)致NF-κB p65顯著上調(diào)，誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，進(jìn)而致Aβ1-42蛋白的大量沉積，損傷海馬組織，而經(jīng)過TAK-242干預(yù)以后，NF-κB p65、TLR4和Aβ1-42表達(dá)顯著下降。Tau蛋白也是神經(jīng)炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)，其功能主要是促進(jìn)微管的形成和保持微管的穩(wěn)定性，目前發(fā)現(xiàn)了21個tau蛋白磷酸化的結(jié)合位點(diǎn)，在神經(jīng)炎癥發(fā)生時，tau蛋白與微管結(jié)合能力減弱，導(dǎo)致細(xì)胞骨架被破壞，同時在神經(jīng)元中形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)，導(dǎo)致突觸蛋白功能缺失，進(jìn)而影響認(rèn)知功能[14-15]。在本實(shí)驗中，中樞炎癥老年小鼠p-tau (S396)在海馬中表達(dá)量都較對照組明顯增多，表明中樞炎癥時會導(dǎo)致大腦中tau蛋白磷酸化程度大量地增加;經(jīng)過TAK-242治療，中樞炎癥老年小鼠海馬組織中p-tau (S396)的表達(dá)量明顯減少。

綜上所述，TAK-242對膿毒癥腦病小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙具有改善效應(yīng)，其機(jī)制可能是：通過抑制中樞炎癥反應(yīng)，減少大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，從而減少海馬區(qū)炎癥因子的產(chǎn)生并下調(diào)炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)。

Figure 4. Western blot analysis of inflammatory proteins NF-κB p65, TLR4， Aβ1-42 and p-tau (S396) in brain tissues. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsCON group;#P<0.05,##P<0.01vsLPS group.

圖4各組海馬炎癥相關(guān)蛋白NF-κBp65、TLR4、Aβ1-42和p-tau(S396)蛋白水平