蘇柳杭， 陳炳秀， 李兆愷， 吳 堯， 張翠俠， 梅萬春， 江宏飛， 王 焱， 戴翠蓮

(廈門大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院心內(nèi)科， 福建 廈門 361004)

巨噬細(xì)胞在動脈粥樣硬化的發(fā)生中起重要作用[1]。動脈粥樣硬化的微環(huán)境促使巨噬細(xì)胞向不同亞型分化從而影響斑塊的進(jìn)展，但其中機(jī)制尚不完全清楚[2]。既往研究表明，動脈粥樣硬化是輔助性T細(xì)胞(help T cells, Th)驅(qū)動的疾病，是由于脂質(zhì)刺激所致1型巨噬細(xì)胞(type 1 macrophage，M1)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)[3]；選擇性激活的2型巨噬細(xì)胞(type 2 macrophage，M2)可通過促進(jìn)炎癥吸收和組織修復(fù)來平衡M1的致炎作用[4-5]。

CD163是特異表達(dá)于M2巨噬細(xì)胞的膜表面蛋白[6]。研究表明，CD163陽性M2可通過吞噬血紅蛋白-觸珠蛋白復(fù)合體(hemoglobin-haptoglobin complex，Hb-Hp)發(fā)揮抗炎作用[7]；也有不同的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD163陽性巨噬細(xì)胞通過Hb-Hp/CD163/缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF1α)途徑，促進(jìn)血管壁通透性增加和白細(xì)胞浸潤[8]，故目前CD163陽性巨噬細(xì)胞在動脈粥樣硬化中的作用認(rèn)識還不盡一致[9]。除Hb-Hp外，CD163還可與其選擇性配體——腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導(dǎo)因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)結(jié)合，但CD163是否可通過調(diào)控TWEAK而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用還不清楚。本課題將對此問題進(jìn)行探討。

材 料 和 方 法

1 動物

8～10周的載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E gene knockout，APOE-/-)及野生型(wild-type,WT)C57BL/6小鼠，雌雄各半，體重20～25 g，購于北京維通利華動物實驗中心，許可證號SCXK(京)2011-0011，廈門大學(xué)實驗動物中心提供SPF級飼養(yǎng)場所。所有動物實驗程序符合美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)實驗動物治療指南，并經(jīng)廈門大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2 主要試劑及儀器

重組小鼠CD163蛋白(recombinant mouse CD163, rmCD163)購自R&D；氧化型低密度脂蛋白(oxidized low- density lipoprotein，ox-LDL)購自廣州奕源生物科技有限公司；兔抗鼠TWEAK抗體、大鼠抗鼠CD68抗體、兔抗鼠CD163抗體、兔抗鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗體和兔抗鼠核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)抗體購自Abcam；油紅O購自Sigma-Aldrich；VECTASTAIN?ABC試劑購自Vector；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；高脂飼料購自Research Diet。激光共聚焦顯微鏡購自Leica；冰凍切片機(jī)購自Leica；蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1動物實驗分組 實驗動物分為以下4組(n=10)：APOE-/-+普食(normal diet, ND)組、APOE-/-+高脂飲食(western diet, WD)組、WT+ND組和WT+WD組。

3.2建立動脈粥樣硬化模型 各組小鼠分別進(jìn)行高脂或普食喂養(yǎng)，16周后測量血脂水平及進(jìn)行主動脈油紅O染色以確定動脈粥樣硬化模型建立成功。具體如下：分別于實驗前及喂養(yǎng)16周后眼球取血，甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶法測總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)的水平，實驗方法按照說明書操作。

3.3主動脈油紅O染色 分離主動脈，4%多聚甲醛固定24 h后，置于100% 1,2-丙二醇溶液中平衡1 min，將主動脈置于新鮮配置的油紅O中染色4 h，85% 1,2-丙二醇溶液中平衡后照相。使用ImageJ軟件測量主動脈斑塊面積與主動脈面積的比值。

3.4Western blot檢測相關(guān)靶蛋白水平 分離小鼠主動脈并置入玻璃勻漿器中，加入RIPA蛋白裂解液+蛋白酶抑制劑+磷酸酶抑制劑配制的組織裂解液，在冰上研磨后離心取上清，-80 ℃保存用于進(jìn)一步實驗。將蛋白質(zhì)用SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶封閉液封閉1 h，加入兔抗鼠CD163抗體(1 ∶1 000)和兔抗鼠TWEAK抗體(1 ∶2 000)并4 ℃過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate-buffered saline+Tween 20，PBST)洗3次，每次5 min；予辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 II 抗(1 ∶10 000)孵育1 h，顯影后成像并拍照，條帶灰度分析由ImageJ軟件進(jìn)行，以β-actin作為內(nèi)參照，計算目標(biāo)條帶灰度/β-actin條帶灰度值。

3.5免疫組化染色 取APOE-/-小鼠主動脈瓣膜冰凍切片37 ℃過夜干燥；預(yù)冷丙酮處理后，Bioxall孵育10 min；加入Biotin后阻斷血清封閉20 min；PBS洗3次,每次5 min，4 ℃濕盒中孵育兔抗鼠單克隆CD163(1 ∶ 200)或兔抗鼠多克隆TWEAK抗體(1∶ 200)過夜；PBS洗5次，每次5 min；稀釋的生物素化 II 抗孵育30 min，VECTASTAIN?ABC孵育30 min；加入過氧化物酶底物，蘇木精染核60 s，自來水沖洗后置于1%鹽酸乙醇中分化至核呈藍(lán)色；使用奧林巴斯倒置顯微鏡下200倍和400倍高倍照相。

3.6巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 于APOE-/-小鼠腹腔注射3%巰基乙醇酸溶液，72 h后于腹腔注射10 mL PBS，收集腹腔細(xì)胞，800 r/min離心10 min后棄上清；加入1 mL DMEM重懸細(xì)胞沉淀(5%胎牛血清+1%青、鏈霉素)，計數(shù)后以1.5×109/L(細(xì)胞培養(yǎng))或5×108/L(激光共聚焦顯微鏡)的細(xì)胞密度鋪12孔板，2 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)穩(wěn)定24 h后進(jìn)行以下實驗。

3.7rmCD163誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞并行Western blot檢測相關(guān)靶蛋白水平 穩(wěn)定24 h后的巨噬細(xì)胞分為2組，一組加入rmCD163蛋白(0.5 mg/L)刺激細(xì)胞，另一組則加入CD163 siRNA、同型對照(isotype control)或空白對照(medium)刺激巨噬細(xì)胞作為對照，刺激48 h 后棄上清，以RIPA+苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)+磷酸酶抑制劑配制裂解液加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，充分裂解后移入離心管中，細(xì)胞超聲儀充分裂解后離心取上清，-80 ℃保存蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶封閉液封閉1 h，加入兔抗鼠TWEAK抗體(1 ∶1 000)、兔抗鼠CD163抗體(1∶1 000)、兔抗鼠NF-κB抗體(1∶1 000)和鼠抗鼠β-actin抗體(1∶1 000)4 ℃過夜，PBST洗3次,每次5 min；予辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔及鼠 II 抗(1∶10 000)孵育1 h，顯影后成像并拍照，條帶灰度分析由ImageJ軟件進(jìn)行，以β-actin作為內(nèi)參照，計算目標(biāo)條帶灰度與β-actin條帶灰度比值。

3.8誘導(dǎo)并使用rmCD163蛋白刺激泡沫細(xì)胞，Western blot檢測相關(guān)靶蛋白 在穩(wěn)定24 h后的腹腔巨噬細(xì)胞中加入無血清DMEM配制的ox-LDL(100 mg/L)，刺激48 h后成為泡沫細(xì)胞，并分別用rmCD163蛋白及其對照刺激后棄上清，收集細(xì)胞并提取蛋白質(zhì)行Western blot，方法同3.7。

3.9激光共聚焦顯微鏡觀察 將腹腔細(xì)胞用多聚甲醛固定 30 min后，用含10%山羊血清的PBS封閉1 h 后， 兔抗鼠CD163抗體(1∶100)、大鼠抗鼠CD68抗體(1∶100)和兔抗鼠iNOS抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，每次5 min；室溫孵育山羊抗大鼠熒光 II 抗(1∶200)和山羊抗兔熒光 II 抗(1∶200)1 h；二脒基苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)1 μL+5 mL PBS染核15 min；PBS洗滌3次，每次10 min；激光共聚焦顯微鏡拍照。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有實驗重復(fù)3次。兩組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用t檢驗，多組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動脈粥樣硬化模型構(gòu)建成功

與WT+ND和WT+WD小鼠相比，APOE-/-+ND和APOE-/-+WD小鼠的總膽固醇水平、甘油三酯水平及低密度脂蛋白膽固醇水平均顯著增高(P<0.01)，高密度脂蛋白膽固醇顯著降低(P<0.01)，但上述指標(biāo)在APOE-/-+ND組和APOE-/-+WD組之間無顯著差異，見圖1A～D。與WT+ND組和WT+WD組相比，無論是主動脈斑塊面積/主動脈面積還是主動脈弓斑塊面積/主動脈弓面積，APOE-/-+ND 組和APOE-/-+WD組均顯著增加(P<0.01)，見圖1E～G。上述結(jié)果說明動脈粥樣硬化模型構(gòu)建成功。

2 各組主動脈相關(guān)蛋白表達(dá)

與野生型小鼠相比，無論是高脂喂養(yǎng)還是普食喂養(yǎng)，APOE-/-小鼠主動脈CD163的表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，與之相對應(yīng)的是，APOE-/-小鼠其主動脈中TWEAK表達(dá)水平較野生型小鼠亦顯著升高(P<0.05)，見圖2。

3 小鼠主動脈斑塊CD163與TWEAK的免疫組化染色

取主動脈斑塊進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示，在動脈粥樣硬化斑塊的肩部及遠(yuǎn)離脂質(zhì)核心的部位可見CD163陽性表達(dá)巨噬細(xì)胞，而在動脈粥樣硬化斑塊的脂質(zhì)核心部位，CD163陽性巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著減少。TWEAK染色結(jié)果顯示，在動脈粥樣硬化斑塊的所有部位，包括肩部和脂質(zhì)核心部位均可見TWEAK陽性細(xì)胞，見圖3。

4 激光共聚焦掃描顯微鏡證明從腹腔獲得的細(xì)胞為巨噬細(xì)胞

以CD68作為巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，將從腹腔提取的巨噬細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡檢測，結(jié)果顯示CD68陽性表達(dá)，iNOS陽性表達(dá)，CD163陰性表達(dá)，說明提取細(xì)胞均為巨噬細(xì)胞,且均為M1，見圖4。

Figure 1.The plasma lipid levels and atherosclerotic plaque size in the mouse aorta. A: TC level; B: TG level; C: LDL-C level; D: HDL-C level; E: oil red O staining in each group (scale bar=1 cm); F: aortic plaque size; G: aortic arch plaque area. Mean±SD.n=10.*P<0.05,**P<0.01vsWT+WD group.

圖1各組小鼠血脂水平及動脈粥樣硬化斑塊面積

Figure 2.CD163 and TWEAK protein expression in the aorta of each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsWT+ND group.

圖2主動脈CD163及TWEAK的表達(dá)水平

Figure 3.Immunohistochemical staining of aortic atherosclerotic plaques. The arrows indicate positive cells.

圖3各組小鼠主動脈免疫組化結(jié)果

Figure 4.Confocal microscopic observation of mercaptoethanol- induced macrophages fromAPOE-/-mice. CD68 was macrophage marker, CD163 was M2 macrophage marker, and iNOS was M1 macrophage marker.The scale bar=250 μm.

圖4腹腔細(xì)胞免疫熒光標(biāo)志的激光共聚焦顯微鏡觀察

5 腹腔巨噬細(xì)胞CD163及TWEAK的蛋白表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示，腹腔巨噬細(xì)胞不表達(dá)CD163，即為M1，但可見TWEAK條帶，說明M1表達(dá)TWEAK；當(dāng)用外源性重組CD163刺激M1，則TWEAK的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖5A。

6 CD163通過下調(diào)TWEAK水平抑制NF-κB表達(dá)

為研究CD163/TWEAK的下游作用途徑，我們進(jìn)一步檢測了M1巨噬細(xì)胞及泡沫細(xì)胞中CD163、TWEAK及TWEAK的下游作用靶點NF-κB的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示在CD163刺激組，無論是M1巨噬細(xì)胞還是泡沫細(xì)胞，TWEAK及NF-κB蛋白質(zhì)表達(dá)顯著受到抑制(P<0.05,P<0.01)，見圖5B。

Figure 5. The protein levels of TWEAK and NF-κB in M1 macrophages and foam cells were detected by Western blot.A: the protein level of TWEAK in the M1 macrophages induced by rmCD163; B: the TWEAK and NF-κB protein levels in M1 macrophage and foam cells induced by rmCD163,CD163 siRNA and isotype (Iso). Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vssiRNA and Iso groups.

圖5CD163對M1型巨噬細(xì)胞及泡沫細(xì)胞TWEAK及NF-κB的調(diào)節(jié)作用檢測

討 論

現(xiàn)有的研究已證明，炎癥參與冠心病事件鏈的全程，在冠心病標(biāo)準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)上，用IL-1β單克隆抗體抗炎治療，可將心肌梗死患者一年后心血管事件的殘余風(fēng)險[10]進(jìn)一步降低15%[11]，5年心血管事件的風(fēng)險進(jìn)一步下降20%[12]，故炎癥損傷對心血管預(yù)后具有重要作用。本研究著重于巨噬細(xì)胞相關(guān)的炎癥調(diào)節(jié)通路在動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用探討。

1 CD163及TWEAK在小鼠動脈粥樣硬化中的表達(dá)變化

CD163特異表達(dá)于單核-巨噬細(xì)胞表面，作為血紅蛋白清道夫受體而被認(rèn)識[13-14]，被認(rèn)為具有抗炎及抗動脈粥樣硬化作用。新近研究發(fā)現(xiàn)TWEAK具有致動脈粥樣硬化作用，下調(diào)TWEAK水平，動脈粥樣硬化斑塊面積顯著減少[15]。由于TWEAK與Hb-Hp在分子結(jié)構(gòu)上存在相似區(qū)域，且與CD163之間存在多個相同的作用位點[16-17]，故本實驗首先在動脈粥樣硬化模型上研究CD163及TWEAK的表達(dá)水平及其空間分布特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，無論是高脂飲食還是普食喂養(yǎng)的APOE-/-小鼠，其主動脈CD163及TWEAK的蛋白表達(dá)水平均顯著增加，即動脈粥樣硬化的微環(huán)境可能同時刺激了組織巨噬細(xì)胞CD163及TWEAK的表達(dá)。但二者在動脈粥樣硬化斑塊中共存的意義何在，是發(fā)揮抗炎還是致動脈粥樣硬化作用目前還不清楚。已有研究表明，一方面TWEAK可通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶水平以降解細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，減少斑塊的穩(wěn)定性[18]，另一方面在APOE-/-小鼠中，TWEAK參與了血管重塑、血管的炎癥反應(yīng)并增加動脈粥樣硬化損傷面積[19]，現(xiàn)有多項研究證明CD163具有抗動脈粥樣硬化作用，但作為TWEAK的選擇性配體[20]，CD163表達(dá)水平增高可否下調(diào)TWEAK表達(dá)，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[21]尚需進(jìn)一步證明。

為了探究此問題，我們對動脈粥樣硬化斑塊進(jìn)行了免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)均可見CD163與TWEAK陽性表達(dá)，這與Western blot結(jié)果一致，另外CD163陽性巨噬細(xì)胞多存在于動脈粥樣硬化斑塊遠(yuǎn)離脂質(zhì)核心的部位，而無論在脂質(zhì)核心還是肩部均可見TWEAK的強陽性表達(dá)，TWEAK表達(dá)于整個動脈粥樣硬化斑塊中，故猜測，動脈粥樣硬化的微環(huán)境可刺激巨噬細(xì)胞上調(diào)CD163及TWEAK的水平。由于CD163多表達(dá)于斑塊穩(wěn)定部位，故二者的上調(diào)可能具有不同的意義，例如預(yù)示著通過上調(diào)CD163來下調(diào)TWEAK的表達(dá)或內(nèi)吞TWEAK，發(fā)揮穩(wěn)定斑塊的作用。

2 CD163下調(diào)巨噬細(xì)胞及泡沫細(xì)胞TWEAK的蛋白表達(dá)

為進(jìn)一步研究CD163可否調(diào)節(jié)TWEAK的表達(dá)，課題組收集APOE-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡證實為M1(M1標(biāo)志物iNOS的表達(dá)陽性)，并誘導(dǎo)成為泡沫細(xì)胞后，我們同時檢測了M1和泡沫細(xì)胞CD163和TWEAK的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示M1及泡沫細(xì)胞不表達(dá)CD163，但表達(dá)TWEAK；在加入外源性重組CD163后，TWEAK的蛋白水平在二者中均顯著受到抑制。本細(xì)胞實驗證明CD163可顯著下調(diào)M1和泡沫細(xì)胞中TWEAK的蛋白水平，且首次證明泡沫細(xì)胞為M1源性，推測CD163下調(diào)TWEAK水平可能與抑制M1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[22]有關(guān)。

3 CD163通過抑制TWEAK表達(dá)下調(diào)NF-κB水平

既往研究顯示，TWEAK可能通過激活經(jīng)典NF-κB途徑[23]、激活MAKP途徑[24]、上調(diào)血管細(xì)胞黏附分子1(vascular adhesion molecule 1， VCAM-1)和細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)[25]及增加基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein, MMP-9)的表達(dá)和活性[15]而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。為了研究CD163/TWEAK的下游作用途徑，我們檢測了M1及泡沫細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)情況，結(jié)果再次顯示，無論是M1還是泡沫細(xì)胞，CD163能夠顯著抑制TWEAK的表達(dá)，而且，也顯著下調(diào)了TWEAK下游的炎癥因子NF-κB的蛋白水平，故證明在動脈粥樣硬化的微環(huán)境中，CD163可通過作用于TWEAK而抑制NF-κB的水平，可能發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化的微環(huán)境中，CD163及其配體TWEAK的蛋白水平顯著增加。CD163陽性巨噬細(xì)胞主要存在于斑塊中遠(yuǎn)離脂質(zhì)核心的部位，并可能通過抑制TWEAK/NF-κB信號途徑發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。