祝高紅, 王筱雯， 戚 暢， 欒江威

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院腎病內(nèi)科， 湖北 武漢 430010)

急性腎損傷是一種嚴(yán)重危害人類健康的臨床危重癥，可導(dǎo)致機(jī)體多種器官發(fā)生損傷[1-2]。近年來(lái)臨床治療和研究急性腎損傷的技術(shù)在不斷提高，但仍然無(wú)法解決急性腎損傷患者住院周期長(zhǎng)、耗費(fèi)醫(yī)療資源多及預(yù)后差等問(wèn)題，給社會(huì)和家庭帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，研究表明腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的增加、氧化應(yīng)激、炎癥以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等異常在急性腎損傷的發(fā)生、發(fā)展中起作用作用[3-6]。

C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白。在細(xì)胞的凋亡過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化CHOP，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。研究表明，腎組織中CHOP的表達(dá)量異常，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，加重腎損傷程度，提示CHOP在腎損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7-8]。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)特異性敲減CHOP的表達(dá)量，觀察其表達(dá)量的變化對(duì)體外培養(yǎng)的腎小管上皮HK2細(xì)胞凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 一般資料

收集2014年～2017年武漢市兒童醫(yī)院腎內(nèi)科1～10歲腎損傷患者103例以及健康對(duì)照98例，1 000×g離心收集患者靜脈血清，患者或其家屬均簽署知情同意書，并由武漢市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

腎小管上皮HK2細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；青-鏈霉素、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)、MTT試劑盒和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)購(gòu)自Sigma；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購(gòu)自上海普飛生物公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物有限公司；TRIzol購(gòu)自Invitrogen；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自杭州吉諾生物有限公司；siRNA購(gòu)自上海吉瑪生物公司；抗CHOP抗體和抗GAPDH抗體購(gòu)自北京博奧森生物有限公司；抗細(xì)胞核抗原Ki-67抗體、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體、caspase-3抗體及cleaved caspase-3抗體購(gòu)自Cellular Signaling Technology。PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自BIO-RAD；酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾公司。

3 方法

3.1qPCR實(shí)驗(yàn) 根據(jù)TRIzol試劑說(shuō)明書提取血清或細(xì)胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。上海生工合成CHOP引物，CHOP的上游引物序列為5’-AGTCTCTGCCTTTCGCCTTT-3’，下游引物序列為5’-GGTGCTTGTGACCTCTGCT-3’。反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40 cycles。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算CHOP mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

3.2細(xì)胞的培養(yǎng)和處理 腎小管上皮細(xì)胞HK2培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%的青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到80%左右，加入胰酶進(jìn)行消化、傳代。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，加入TGF-β1(5 μg/L)處理細(xì)胞，構(gòu)建腎小管上皮細(xì)胞損傷模型[9]。

3.3Western blot實(shí)驗(yàn) 提取各組細(xì)胞中的總蛋白，BCA法檢測(cè)濃度，沸水變性10 min；吸取40 μg總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE。將分離得到的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜中，室溫下置于5%的脫脂奶粉溶液中封閉30 min；加入 I 抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗后加入 II 抗，37 ℃孵育2 h，TBST漂洗后加入ECL液孵育5 min，曝光、拍照，Quantity One分析蛋白質(zhì)灰度值。

3.4細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 腎小管上皮HK2細(xì)胞分為3組：對(duì)照(control)組、陰性(negative)組和si-CHOP組。對(duì)照組為常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞，陰性組和si-CHOP組分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA和CHOPsiRNA。轉(zhuǎn)染前24 h，將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到90%，根據(jù)Lipofectamine 2000說(shuō)明書開始轉(zhuǎn)染，qPCR和Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效果。

3.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將各組腎小管上皮HK2細(xì)胞的密度調(diào)整5×103個(gè)，接種于96孔板上，培養(yǎng)48 h后，加入20 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，加入200 μL DMSO，酶標(biāo)儀中檢測(cè)細(xì)胞在570 nm的吸光度(A)。

3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況 調(diào)整腎小管上皮HK2細(xì)胞密度為1×109/L，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL 膜聯(lián)蛋白 V-FITC和5 μL 碘化丙啶，避光，4 ℃染色15 min，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的凋亡率。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(mean±SD)。兩組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CHOP mRNA在腎損傷患者血清中的水平

qPCR檢測(cè)健康對(duì)照和腎損傷患者血清中CHOP的mRNA水平，結(jié)果顯示腎損傷患者血清中CHOP的mRNA水平明顯高于健康對(duì)照者(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The mRNA levels of CHOP were detected by qPCR. Mean±SD.*P<0.05vshealth control.

圖1qPCR檢測(cè)CHOP的mRNA水平

2 敲減CHOP表達(dá)對(duì)腎小管上皮HK2細(xì)胞中CHOP表達(dá)量的影響

腎小管上皮HK2細(xì)胞轉(zhuǎn)染CHOPsiRNA后，CHOP的mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低(P<0.05),見圖2。

3 敲減CHOP表達(dá)對(duì)腎小管上皮HK2細(xì)胞活力的影響

敲減CHOP表達(dá)后，腎小管上皮HK2細(xì)胞的活力較對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P<0.05)，見圖3。

4 敲減CHOP表達(dá)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞HK2凋亡的影響

敲減CHOP表達(dá)后，腎小管上皮HK2細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組顯著降低(P<0.05),見圖4。

Figure 2.The mRNA expression of CHOP was detected by qPCR after transfection.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CHOP的mRNA表達(dá)量

Figure 3.The effect ofCHOPexpression knock-down on the viability of renal tubular epithelial HK2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3敲減CHOP表達(dá)對(duì)腎小管上皮HK2細(xì)胞活力的影響

5 敲減CHOP表達(dá)對(duì)增殖和凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

與對(duì)照組相比，敲減CHOP表達(dá)顯著增加腎小管上皮HK2細(xì)胞中Ki-67和PCNA的蛋白水平，降低cleaved caspase-3的蛋白水平(P<0.05)，但對(duì)caspase-3蛋白水平無(wú)顯著影響，見圖5。

Figure 4.The effect ofCHOPexpression knock-down on the apoptosis of renal tubular epithelial HK2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4敲減CHOP表達(dá)對(duì)腎小管上皮HK2細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5.The effect ofCHOPexpression knock-down on the expression levels of proliferation- and apoptosis-related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5敲減CHOP表達(dá)對(duì)增殖和凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

討 論

急性腎損傷是一種發(fā)病率較高的臨床危重癥，受多種原因的影響導(dǎo)致腎功能低下，伴有少尿或無(wú)尿的癥狀，其死亡率較高。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在急性腎損傷發(fā)病機(jī)制中起重要作用，并在急性腎損傷的預(yù)防、診斷和治療過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，有望成為治療急性腎損傷的新靶點(diǎn)，具有重要的應(yīng)用前景[10-11]。因此研究急性腎損傷的分子機(jī)制、尋找治療急性腎損傷的新靶點(diǎn)，有助于提高其治療手段，降低急性腎損傷的死亡率以及提高其預(yù)后，對(duì)早期診斷、治療急性腎損傷具有重要意義。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的重要轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá)。機(jī)體在正常狀態(tài)下，CHOP在細(xì)胞漿中少量表達(dá)，當(dāng)病理狀態(tài)下，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)CHOP的表達(dá)量，調(diào)控基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在穿心蓮內(nèi)脂誘導(dǎo)的腎小管上皮HK2細(xì)胞凋亡增加的過(guò)程中，降低CHOP表達(dá)量顯著抑制細(xì)胞的凋亡[12]。醛固酮可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡率升高，加重腎損傷過(guò)程，siRNA特異性降低CHOP表達(dá)量可逆轉(zhuǎn)醛固酮的腎損傷作用[13]，表明CHOP在腎損傷導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在本實(shí)驗(yàn)中，腎損傷患者的血清中CHOP表達(dá)量顯著高于健康對(duì)照組，表明CHOP的表達(dá)量調(diào)節(jié)腎損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

細(xì)胞的增殖以及凋亡的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)機(jī)體器官和組織正常生長(zhǎng)、發(fā)育具有十分重要的作用。Ki-67、PCNA及caspase-3對(duì)細(xì)胞的增殖和凋亡具有重要意義。Ki-67位于10q2.5染色體上，是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性的重要標(biāo)志物，目前已經(jīng)應(yīng)用于多種腫瘤的早期診斷和預(yù)防過(guò)程中[14-16]。PCNA在正常細(xì)胞以及病理狀態(tài)下的細(xì)胞中均有表達(dá)，是檢測(cè)細(xì)胞異常增殖的關(guān)鍵蛋白。Caspase-3是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路caspase家族的樞紐蛋白，當(dāng)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路被激活，可誘導(dǎo)產(chǎn)生酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活caspase-3蛋白的活化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示，給予TGF-β1構(gòu)建的腎小管上皮HK2細(xì)胞損傷模型中，細(xì)胞中CHOP的表達(dá)量增加，細(xì)胞活力降低，凋亡率顯著升高；轉(zhuǎn)染CHOPsiRNA顯著降低腎小管上皮HK2細(xì)胞中CHOP的表達(dá)量；特異性敲減CHOP的表達(dá)量顯著增加腎小管上皮HK2細(xì)胞的活力，抑制其凋亡，增加Ki-67和PCNA蛋白的表達(dá)，下調(diào)cleaved caspase-3的蛋白水平。

綜上所述，敲減CHOP的表達(dá)量可通過(guò)調(diào)節(jié)增殖和凋亡相關(guān)蛋白水平抑制腎小管上皮HK2細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞的活力。本研究為急性腎損傷的分子診斷和治療提供了潛在的靶點(diǎn)。