李霜青， 應(yīng) 俊， 許旭春

(金華市中心醫(yī)院， 浙江 金華 321000)

腎臟纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎病的共同途徑，其臨床病理形態(tài)包含腎小球硬化，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)異常增多及過(guò)度沉積和腎小管間質(zhì)纖維化，導(dǎo)致腎功能進(jìn)行性下降等[1]。雖然腎臟纖維化早期所造成的腎臟損傷是可逆的，但在瘢痕形成期纖維化損傷則不可逆轉(zhuǎn)，因此，探尋相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)在防治和延緩纖維化進(jìn)展中的作用，對(duì)腎臟纖維化治療策略的制定和預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。多項(xiàng)研究提示，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor-β，TGF-β)在腎臟纖維化過(guò)程中是一種關(guān)鍵促纖維化因子，具有促進(jìn)腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化和ECM沉積等作用[2]。TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)需要轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅠ型受體(TGF-β receptor type 1，TGFBR1)和TGFBR2共同參與，且TGFBR1需要TGFBR2的參與才能激活并與TGF-β結(jié)合從而進(jìn)一步激活下游通路，引發(fā)一系列纖維化效應(yīng)[3]，因此，TGFBR2在TGF-β信號(hào)通路中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)多種微小RNA(microRNA，miRNA，miR)與腎臟纖維化密切相關(guān)，具有成為腎臟纖維化診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)的潛力[4]。本研究通過(guò)分析miR-219靶向調(diào)控TGFBR2在腎臟纖維化中發(fā)揮的作用，并觀察miR-219對(duì)單側(cè)輸尿管閉塞(unilateral ureteral occlusion，UUO)小鼠腎臟纖維化進(jìn)程的影響，為診斷及治療腎臟纖維化提供新的治療方向和研究靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

收集2017年9月～2018年3月在我院就診的70例腎臟纖維化患者，其中男性32例，女性38例；年齡33～65歲，平均年齡(49.36±10.87)歲。選取同期來(lái)本院體檢的20例健康人設(shè)為對(duì)照組，其中男性10例，女性10例；年齡32～66歲，平均年齡(48.60±8.85)歲。2組均符合知情同意原則，性別和年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，具有可比性。入組標(biāo)準(zhǔn)為腎臟纖維化患者均經(jīng)穿刺活檢證實(shí)為腎臟纖維化。排除標(biāo)準(zhǔn)為排除合并泌尿系感染、糖尿病、孕婦和惡性腫瘤的患者。

2 方法

2.1外周血采集 2組均于清晨空腹?fàn)顩r下抽取外周靜脈血3 mL(采用一次性血清分離膠管)，待血清析出后以1 000 ×g離心10 min，取上層血清保存至-80 ℃冰箱待檢測(cè)。

2.2建立UUO小鼠模型 選取7周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠20只， 動(dòng)物合格證號(hào)為SYXK(浙)2018-0012，體質(zhì)量(20±2) g，隨機(jī)分為UUO組和假手術(shù)(sham)組。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±1) ℃，相對(duì)濕度(55±5) %。小鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)，約2 min小鼠麻醉后，UUO組(n=10)取仰臥位固定小鼠，術(shù)前消毒，于無(wú)菌條件下，取腹部正中白線為手術(shù)切口，尋找左側(cè)輸尿管并鈍性分離輸尿管至腎門(mén)，于小鼠腎臟下極和腎門(mén)處分別用絲線結(jié)扎左側(cè)輸尿管，并于兩結(jié)扎處之間剪斷輸尿管，右側(cè)輸尿管不予任何處理，縫合腹膜，消毒，縫合腹直肌和皮膚，再次消毒。假手術(shù)組(n=10)小鼠除不結(jié)扎輸尿管外，其余操作與UUO組相同。

2.3RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 采用TRIzol 法提取總RNA，實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)中步驟進(jìn)行。將提取的總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qPCR反應(yīng)。miR-219的上游引物序列為 5’-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3’，下游引物序列為 5’-TGCTTGATTGTCCAAACG-3’；U6的上游引物序列為 5’-GCAGTGCTTAGCTGGTTGT-3’，下游引物序列為 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；TGFBR2的上游引物序列為 5’-CTAACCTGCTGCCTGTGTGA-3’，下游引物序列為 5’-TCTGGAGCCATGTATCTTGC-3’；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的上游引物序列為 5’-TACTGCCGAGCGTGAGAT-3’，下游引物序列為 5’-GCTTCCTCGTATTCCTGTTT-3’；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor, CTGF)的上游引物序列為 5’-CAAAGCAGCTGCAAATACCA-3’，下游引物序列為 5’-GGCCAAATGTGTCTTCCAGT-3’；Ⅰ型膠原α1鏈(type Ⅰ collagen α1, COL1A1)的上游引物序列為 5’-AACATAATCCGCAGTGGCCT-3’，下游引物序列為 5’-CTCCTGTTGCGTTGCTCCTT-3’；COL3A1的上游引物序列為 5’-CCCAGAACATCACATATCAC-3’，下游引物序列為 5’-CAAGAGGAACACATATGGAG-3’；GAPDH的上游引物序列為 5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’，下游引物序列為 5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s， 72 ℃ 60 s， 35個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 7 min。每個(gè)檢測(cè)指標(biāo)設(shè)3個(gè)平行樣，每次檢測(cè)結(jié)果均重復(fù)3次。

2.4細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 大鼠腎成纖維細(xì)胞NRK49F在37 ℃、5% CO2條件下，置于含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每3 d換液1次，3～5 d傳代1次。按照說(shuō)明書(shū)分別將miR-219模擬物(miR-219 mimics)和陰性對(duì)照(negative control) miRNA mimics (NC)轉(zhuǎn)染進(jìn)NRK49F細(xì)胞。

2.5螢光素酶報(bào)告分析 構(gòu)建TGFBR2野生型3’-UTR螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-WT，并以pMIR-WT質(zhì)粒為模板，利用PCR搭橋法(overlapping PCR)構(gòu)建其潛在結(jié)合位點(diǎn)突變型報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-Mut。將miR-219mimics、內(nèi)參照海腎螢光素酶以及pMIR-WT和pMIR-Mut報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)NRF49F細(xì)胞中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，用Passive Lysis Buffer裂解細(xì)胞后分析雙螢光素酶活性。

2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 采用含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、150 mmol/L NaCl、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1% SDS和蛋白酶抑制劑及1 mmol/L苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液分離蛋白質(zhì)。通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分離，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGFBR2和α-SMA的蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7HE和Masson’s trichrome染色 切取UUO小鼠腎臟標(biāo)本并用固定液固定，浸蠟包埋，固定于切片機(jī)上切片成3～5 μm薄片，按照說(shuō)明書(shū)分別采用HE染色和Masson’s trichrome染色對(duì)假手術(shù)組小鼠、UUO組小鼠和UUO+miR-219組小鼠腎臟進(jìn)行纖維化分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組組間多重比較采用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-219在腎纖維化患者血清及UUO小鼠腎臟中的水平

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-219在腎纖維化患者血清中的水平明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)圖1A。與假手術(shù)組小鼠相比，miR-219在UUO小鼠腎臟組織內(nèi)表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)， 見(jiàn)圖1B。以上結(jié)果均提示miR-219可能與腎臟纖維化存在相關(guān)性。

Figure 1.The miR-219 expression in the serum of patients with renal fibrosis (A) and the renal tissue of UUO mice (B). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vssham group.

圖1miR-219在腎纖維化患者及UUO小鼠中表達(dá)的變化

2 miR-219抑制NRK49F細(xì)胞α-SMA的表達(dá)

使用AngII(10-7mol/L)刺激NRK49F細(xì)胞24 h后，RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，AngII處理組中miR-219的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2A。將miR-219 mimics和NC分別轉(zhuǎn)染進(jìn)NRK49F細(xì)胞中并采用AngII(10-7mol/L)進(jìn)行刺激24 h，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，AngII處理組中的α-SMA蛋白表達(dá)升高，但AngII+miR-219 mimics組中的α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯低于AngII處理組(P<0.01),見(jiàn)圖2B，這表明AngII刺激NRK49F細(xì)胞對(duì)α-SMA表達(dá)的促進(jìn)效果會(huì)被miR-219 mimics抑制，提示miR-219可下調(diào)α-SMA的表達(dá)并抑制AngII誘導(dǎo)的腎臟細(xì)胞纖維化。

3 miR-219通過(guò)結(jié)合NRK49F細(xì)胞TGFBR2的 3’-UTR來(lái)抑制TGFBR2的表達(dá)

通過(guò)microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan進(jìn)行篩選預(yù)測(cè)，確定miR-219的潛在靶基因?yàn)門(mén)GFBR2，見(jiàn)圖3A。通過(guò)構(gòu)建TGFBR2野生型3’-UTR螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-WT及突變型報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-Mut，驗(yàn)證TGFBR2為miR-219的靶基因。

Figure 2.The expression of α-SMA at mRNA and protein levels was inhibited by miR-219. A: the miR-219 expression in the NRK49F cells treated with AngII; B:the protein expression of α-SMA in the NRK49F cell treated with AngII and/or miR-219 mimics was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsAngII group.

圖2miR-219抑制α-SMA的表達(dá)

將miR-219 mimics和NC miRNA mimics以及pMIR-WT和pMIR-Mut報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)NRF49F細(xì)胞中，雙螢光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-219 mimics可明顯抑制pMIR-WT質(zhì)粒螢光素酶的活性(P<0.01)；而對(duì)pMIR-Mut螢光素酶的活性無(wú)明顯影響,見(jiàn)圖3B。該結(jié)果顯示miR-219可結(jié)合TGFBR2的3’-UTR并抑制TGFBR2的表達(dá)。

4 miR-219抑制TGFBR2的mRNA及蛋白表達(dá)水平

為進(jìn)一步證明miR-219對(duì)NRK49F細(xì)胞TGFBR2的調(diào)控作用，采用RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比NC組，miR-219 mimics轉(zhuǎn)染組TGFBR2的 mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.01)，見(jiàn)圖4A。同時(shí)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相比NC組，miR-219 mimics轉(zhuǎn)染組TGFBR2蛋白的表達(dá)量明顯下降(P<0.01)，見(jiàn)圖4B。以上結(jié)果表明miRNA-219可以抑制TGFBR2的mRNA及蛋白表達(dá)。

5 miR-219抑制α-SMA、CTGF、COL1A1和COL3A1的mRNA表達(dá)水平

RT-qPCR檢測(cè)對(duì)照組和miR-219 mimics轉(zhuǎn)染組中腎臟纖維化因子α-SMA、CTGF、COL1A1和COL3A1的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，miR-219 mimics轉(zhuǎn)染組中上述纖維化因子的mRNA表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖5。這些結(jié)果表明，miR-219能夠抑制腎臟纖維化的進(jìn)程。

6 miR-219對(duì)UUO小鼠腎臟纖維化的影響

HE染色顯示，假手術(shù)組小鼠腎小管和腎小球結(jié)構(gòu)清晰，上皮細(xì)胞排列整齊，小管基底膜較完整，間質(zhì)中未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；UUO小鼠腎小球擴(kuò)張，上皮細(xì)胞變性萎縮壞死；但UUO小鼠在注射miR-219(30 mg/kg，每隔3天注射1次)后，腎纖維化進(jìn)程則明顯受到抑制。Masson’s trichrome染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比UUO小鼠，UUO+ miRNA-219組小鼠腎臟纖維化區(qū)域減小，細(xì)胞外基質(zhì)沉積變少，見(jiàn)圖6A。同時(shí)我們還觀察到UUO+ miR-219組小鼠腎臟組織中COL1A1和COL3A1的mRNA表達(dá)水平均明顯低于UUO小鼠(P<0.05)，見(jiàn)圖6B。上述結(jié)果表明miR-219在UUO小鼠的腎纖維化進(jìn)程中發(fā)揮抑制作用。

Figure 3.TGFBR2 was the target gene of miR-219 in the NRK49F cells. A: the predicted consequential of target region; B: the dual-luciferase reporter analysis of target gene and miR-219. Mean±SD.n=3.**P<0.01vspMIR group and pMIR-Mut group.

圖3NRK49F細(xì)胞的TGFBR2是miR-219的靶基因

Figure 4.The expression of TGFBR2 at mRNA and protein le-vels was inhibited by miR-219 in the NRK49F cells. A:the mRNA expression of TGFBR2 in the NRK49F cells treated with miR-219 was determined by RT-qPCR; B:the protein expression of TGFBR2 in the NRK49F cells treated with miR-219 mimics was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖4miR-219抑制NRK49F細(xì)胞TGFBR2的mRNA及蛋白表達(dá)水平

討 論

腎臟纖維化的主要臨床表現(xiàn)為腎小球硬化，腎小管萎縮，ECM異常增多及過(guò)度沉積和腎間質(zhì)纖維化等，其病理過(guò)程有多種因子的參與。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β/Smad信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和腺苷信號(hào)通路等多種信號(hào)通路激活與腎臟纖維化緊密相關(guān)[5]，且隨著對(duì)miRNAs研究的不斷深入，越來(lái)越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)與腎纖維化具有相關(guān)性。

miRNA是一類(lèi)具有高度保守性的長(zhǎng)度約為19～25 nt的非編碼單鏈小分子RNA，其通過(guò)與靶基因mRNA的3’-UTR完全或不完全配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)。研究報(bào)道，miR-200a可通過(guò)靶向調(diào)控TGF-β2抑制腎臟纖維化的發(fā)展[6]；miR-29b在大鼠腎臟髓質(zhì)上皮細(xì)胞中可通過(guò)調(diào)控COL1A1，COL3A1和COL4A1等膠原基因表達(dá)，從而具備抗纖維化功能[7]；有學(xué)者檢測(cè)到miR-21在腎纖維化患者腎組織中表達(dá)升高。雖已有多種miRNA與腎臟纖維化的密切關(guān)系被報(bào)道，但miR-219在腎臟纖維化中的作用及影響尚鮮有報(bào)道。本研究首先通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)到腎纖維化患者血清中miR-219的表達(dá)水平明顯低于健康檢查者，并且在構(gòu)建的UUO小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)miR-219在腎臟組織內(nèi)表達(dá)水平顯著降低，這表明miR-219可能與腎臟纖維化存在相關(guān)性。

在腎損傷時(shí)，AngII及其受體在成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，刺激成纖維細(xì)胞增殖，促使ECM生成，促進(jìn)TGF-β血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor, PDGF)等生長(zhǎng)因子分泌而發(fā)揮促纖維化作用。腎損傷同時(shí)，α-SMA表達(dá)升高，標(biāo)志著上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，促使腎間質(zhì)中肌成纖維細(xì)胞聚集，導(dǎo)致ECM合成和分泌增多，促進(jìn)纖維化的形成。研究顯示，在體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中，α-SMA表達(dá)可被TGF-β1上調(diào)且腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化[3]。本研究采用AngII刺激NRK49F細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)miR-219表達(dá)明顯降低，且Western blot結(jié)果顯示α-SMA蛋白表達(dá)升高；進(jìn)一步用AngII刺激轉(zhuǎn)染了miR-219 mimics的NRK49F細(xì)胞，觀察到α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯低于AngII刺激的NRK49F細(xì)胞，上述結(jié)果表明miR-219可抑制α-SMA的表達(dá)及AngII誘導(dǎo)的腎臟細(xì)胞纖維化，提示miR-219可能在腎臟纖維化的過(guò)程中發(fā)揮抑制作用。

TGFBR2是TGF-β II型受體編碼基因，其胞內(nèi)含絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，在肝臟和腎小球中密度最高。TGF-β必須通過(guò)與細(xì)胞膜上包括TGFBR2在內(nèi)的特異性受體結(jié)合，才能發(fā)揮生物學(xué)作用。研究顯示，TGF-β是一種強(qiáng)烈的促纖維化因子，是促進(jìn)腎纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子[8]，TGF-β1是TGF-β家族中最重要的成員之一，可促進(jìn)腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。在纖維化進(jìn)程中，TGF-β1可增加ECM的合成，上調(diào)纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor, PAI)和組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases, TIMPs)表達(dá)并減少基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)生成，抑制ECM降解，趨化并促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，刺激多種細(xì)胞因子合成和分泌，引起ECM過(guò)度沉積，并在腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中發(fā)揮重要作用[9]。TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，TGFBR2可以與TGF-β直接結(jié)合，TGFBR2自身磷酸化后被激活，與TGFBR1結(jié)合形成復(fù)合物并使TGFBR1的GS結(jié)構(gòu)域磷酸化，激活TGFBR1；激活的受體復(fù)合物再通過(guò)Smads依賴(lài)性和MAPK等非Smads依賴(lài)性的途徑發(fā)揮其促纖維化作用。因此TGFBR2在TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及促進(jìn)腎臟纖維化中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，UUO誘導(dǎo)的腎臟纖維化中檢測(cè)到TGFBR1和TGFBR2增加[10]。miR-219可以抑制TGFBR2的表達(dá)并對(duì)TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)通路造成干擾，從而抑制皮膚纖維化。

Figure 5.The mRNA levels of renal fibrosis factors were decreased in the NRK49F cells treated with miR-219. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖5miR-219抑制NRK49F細(xì)胞腎臟纖維化因子的mRNA表達(dá)

Figure 6.The renal fibrosis process was inhibited by miR-219 in the UUO mice. A: the morphology of renal fibrosis in UUO mice treated with miR-219 was detected by HE and Masson staining (×40); B: the mRNA level of fibrosis markers in the renal tissues of UUO mice treated with miR-219. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsUUO group.

圖6miR-219抑制UUO小鼠的纖維化進(jìn)程

本研究通過(guò)miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)TGFBR2是miR-219的潛在靶基因，并通過(guò)雙螢光素酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-219可通過(guò)結(jié)合TGFBR2的3’-UTR進(jìn)而抑制TGFBR2的表達(dá)。同時(shí)通過(guò)RT-qPCR和Western blot確定了miR-219可以抑制TGFBR2的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-219對(duì)TGFBR2的靶向調(diào)控作用。

CTGF與腎臟、皮膚、肺和肝臟等多種組織器官纖維化的進(jìn)程有關(guān)，在腎臟中含量最高。CTGF是TGF-β促纖維化信號(hào)通路的下游因子之一，刺激細(xì)胞增殖及ECM的形成，促進(jìn)腎臟纖維化[11]。ECM的主要成分包括I型膠原和III型膠原，COL1A1和COL3A1分別是I型膠原和III型膠原的組成部分，與腎臟間質(zhì)纖維化密切相關(guān)。本研究中我們發(fā)現(xiàn)NRK49F細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-219 mimics后，α-SMA、CTGF、COL1A1和COL3A1這些腎臟纖維化相關(guān)因子mRNA的表達(dá)均顯著下降，這預(yù)示miR-219能夠通過(guò)抑制TGFBR2的表達(dá)，干擾TGF-β信號(hào)通路，從而抑制腎臟纖維化的發(fā)展。

本研究通過(guò)構(gòu)建了UUO小鼠模型以進(jìn)一步觀察miR-219對(duì)腎臟纖維化的影響。HE染色和Masson’s trichrome染色均顯示，UUO小鼠在注射miR-219后，纖維化進(jìn)程明顯受到抑制。同時(shí)本研究還檢測(cè)到COL1A1和COL3A1的mRNA表達(dá)水平也明顯低于UUO小鼠。這些結(jié)果均表明miR-219可以抑制UUO小鼠腎臟纖維化的發(fā)展。

綜上所述，miR-219可抑制AngII誘導(dǎo)的腎臟細(xì)胞纖維化并下調(diào)腎臟纖維化因子α-SMA、CTGF、COL1A1和COL3A1的表達(dá)，對(duì)UUO小鼠腎臟纖維化產(chǎn)生抑制效果。本研究結(jié)果顯示，miR-219可以結(jié)合TGFBR2的3’-UTR并抑制TGFBR2的表達(dá)，進(jìn)而干擾TGF-β信號(hào)通路，抑制腎臟纖維化的發(fā)展。因此，miR-219可能成為腎臟纖維化診斷及治療的新靶點(diǎn)。