陳潤(rùn)森， 唐凱銳▲， 梁 曙， 鄧遠(yuǎn)軍， 聶 桓， 張玉佩， 金 玲， 楊欽河△

(暨南大學(xué) 1中醫(yī)學(xué)院， 2附屬第一醫(yī)院， 廣東 廣州 510632)

隨著城市化的發(fā)展，人們的生活方式發(fā)生改變并出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)過剩等情況，亞洲地區(qū)非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的患病率高達(dá)25%，成為常見的慢性肝病，其中繼發(fā)于NAFLD的肝細(xì)胞癌和終末期肝病的發(fā)病率也呈現(xiàn)著逐年上升的趨勢(shì)[1]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，現(xiàn)有理論認(rèn)為其發(fā)病與脂肪變性、氧化損傷和腸道菌群紊亂等多種因素有關(guān)[2]。研究表明，沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1, SIRT1)/p53信號(hào)通路的激活與NAFLD脂肪變性和氧化損傷發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[3-4]。近年來，小檗堿的抗氧化和降脂作用已經(jīng)被多次報(bào)道[5-6]。而且我們前期研究表明，小檗堿對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)的NALFD大鼠療效明顯，其通過激活上游腺苷酸活化蛋白激酶來上調(diào)SIRT1蛋白的表達(dá)，從而改善脂質(zhì)代謝紊亂，但其對(duì)下游SIRT1/p53信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響尚有待闡明[7-8]。因此，本研究通過觀察小檗堿對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠模型的干預(yù)作用，并探討其對(duì)SIRT1/p53信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響，以期進(jìn)一步闡明小檗堿對(duì)NAFLD的作用機(jī)制，為小檗堿在臨床上防治NAFLD提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重200 g±20 g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0034。

2 主要試劑、器材與儀器

實(shí)驗(yàn)用藥鹽酸小檗堿片產(chǎn)自赤峰蒙欣藥業(yè)有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H15020568)，購(gòu)自暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房；丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測(cè)試盒、總抗氧化能力(total anti-oxidant capatity, T-AOC)檢測(cè)試劑盒、油紅O試劑盒及總膽固醇(total cholesterol,TC)和甘油三酯(triglyceride, TG)含量測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；OCT冰凍包埋劑購(gòu)自SAKURA；RIPA裂解液和Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；抗SIRT1和GAPDH抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；抗p53和乙?；痯53(acetylated p53,Ac-p53)抗體購(gòu)自Abcam；ECL發(fā)光液購(gòu)自Millipore。冷凍切片機(jī)和電動(dòng)多功能顯微鏡(Leica)；透射電子顯微鏡(TECNAI-10)(Philips)；高通量組織研磨機(jī)(TissueLyser Ⅱ型)(QIAGEN)；多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾儀器有限公司)。

3 方法

3.1動(dòng)物分組及模型建立 大鼠飼養(yǎng)于24 ℃±2 ℃，明暗12 h交替的SPF級(jí)動(dòng)物房[暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心，許可證號(hào)：SYXK(粵)2013-0117]。造模方法采用高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD大鼠模型[8]，其中高脂飼料含基礎(chǔ)飼料88%、豬油10%、膽固醇1.5%和膽鹽0.5%，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002。大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表均分為3組：正常(normal)組、模型(model)組與小檗堿(berberine)組。正常組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，模型組及小檗堿組給予高脂飼料喂養(yǎng)；小檗堿組在造模的同時(shí)給予鹽酸小檗堿(100 mg·kg-1·d-1[9])灌服，其余2組給予等體積的蒸餾水灌服。各組動(dòng)物均自由飲水進(jìn)食，持續(xù)16周。

3.2標(biāo)本采集 連續(xù)用藥16周后，各組動(dòng)物禁食不禁水12 h后，用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，開腹并取腹主動(dòng)脈血，然后取出肝臟，取數(shù)塊右葉肝組織用于病理學(xué)觀察，剩余肝組織于-80 ℃超低溫冰箱保存待測(cè)。

3.3肝組織病理學(xué)觀察 取各組新鮮右葉肝組織的相同部位，OCT包埋后行冰凍切片，箱體溫度-15 ℃，凍頭溫度-20 ℃，切片厚度8 μm，展片后進(jìn)行油紅O染色，染色后鏡檢采集圖像；另取新鮮右葉肝臟組織塊于4%多聚甲醛中固定12 h后，進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋，使用石蠟切片機(jī)切片，厚度為5 μm，行常規(guī)HE染色后鏡檢并采集圖像；取各組新鮮右葉肝組織1 mm×1 mm×1 mm體積，于2.5%戊二醛電鏡固定液中固定24 h，PBS洗后以1%鋨酸固定液固定，丙酮進(jìn)行逐級(jí)脫水，用Epon 812包埋劑進(jìn)行包埋，于60 ℃聚合24 h，超薄切片機(jī)切片后用醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，用透射電子顯微鏡觀察肝組織的超微結(jié)構(gòu)。

3.4生化指標(biāo)分析 各組精確稱取100 mg肝組織，加0.9 mL無水乙醇置于EP管中，采用高通量組織勻漿機(jī)制作肝組織勻漿，4 ℃、956×g，離心10 min，取上清，用TC和TG試劑盒測(cè)定肝組織勻漿上清中TC和TG含量水平。

3.5氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 各組稱取100 mg肝組織，加入0.9 mL生理鹽水后制作肝組織勻漿，4 ℃、664×g，離心10 min，取上清液進(jìn)行肝組織的SOD活性、MDA含量及T-AOC的檢測(cè)，具體步驟按照試劑盒說明書操作。

3.6Western blot檢測(cè)大鼠肝組織SIRT1、 p53和Ac-p53蛋白含量水平 各組稱取20 mg肝組織于EP管中，加入200 μL RIPA裂解液制成肝組織勻漿，離心后取上清，使用Bradford法檢測(cè)上清液中蛋白濃度。樣品經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用TBST稍洗后加入5%脫脂奶粉封閉60 min。洗膜后加Ⅰ抗稀釋液于4 ℃過夜孵育，洗膜后加Ⅱ抗稀釋液置室溫?fù)u床孵育1 h，充分洗滌。選擇GAPDH抗體作為內(nèi)參照。Ⅱ抗孵育后，將膜置于干凈的保鮮膜上，在膜上滴加適量ECL化學(xué)發(fā)光液，確保均勻覆蓋并放置3 min～5 min，后于暗室內(nèi)壓片顯影。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，繪圖軟件采用GraphPad Prism 5.0。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間兩兩比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠一般情況觀察

正常組大鼠毛發(fā)光亮致密，動(dòng)作敏捷，反應(yīng)迅速，大便黑褐色，籠中墊料濕度一般。與正常組相比，模型組大鼠體態(tài)明顯肥胖，體毛枯黃而稀疏，動(dòng)作反應(yīng)遲緩，大便色黃質(zhì)軟有油膩感，籠中墊料濕度大。小檗堿組大鼠在體態(tài)、毛發(fā)、大小便、動(dòng)作反應(yīng)等方面均較模型組好轉(zhuǎn)。體重情況詳見圖1。

Figure 1.The body weight in each group. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsnormal group;▲P<0.05vsmodel group.

圖1各組大鼠體重

2 HE染色

正常組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、呈多邊形，肝索呈放射狀排列，胞質(zhì)呈紫紅色，細(xì)胞核大而圓，處于細(xì)胞中央，偶見少量脂滴；模型組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，肝索放射狀排列不明顯，細(xì)胞明顯腫大如氣球狀，視野中可見大量大小不一圓形脂肪空泡，脂肪空泡將細(xì)胞核壓至一側(cè)；小檗堿組與模型組相比，肝細(xì)胞、肝索結(jié)構(gòu)等有所改善，細(xì)胞形態(tài)好轉(zhuǎn)，脂肪空泡明顯變少,見圖2。

Figure 2.HE staining of liver tissues in rats (scale bar=100 μm).

圖2各組大鼠肝組織HE染色

3 油紅O染色

正常組肝細(xì)胞呈淡紫色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞界限清晰，排列有序，胞內(nèi)未見明顯紅染脂滴。模型組明顯可見肝細(xì)胞腫大，胞內(nèi)大量橘紅色脂滴，胞核被擠至一側(cè)，甚至相鄰細(xì)胞內(nèi)脂滴融合。小檗堿組視野中橘紅色脂滴明顯減少，細(xì)胞形態(tài)等都有不同程度改善,見圖3。

Figure 3.Oil red O staining of liver tissues in rats (scale bar=100 μm).

圖3各組大鼠肝組織油紅O染色

4 透射電鏡觀察

正常組中肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞內(nèi)線粒體豐富，胞質(zhì)中偶見少量脂滴分布，直徑少于1 μm，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常。模型組中肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，邊界不清，胞內(nèi)線粒體腫脹，胞質(zhì)內(nèi)有大量不同大小的圓形脂滴，部分脂滴直徑可達(dá)3 μm，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。與模型組相比，小檗堿組的肝細(xì)胞中脂滴直徑與聚集程度都明顯減小，最大的脂滴直徑為2 μm，線粒體腫脹和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷明顯減輕,見圖4。

Figure 4.Transmission electron microscopic photographs of liver tissues in rats (scale bar=2 μm). Red arrows: adipose degeneration; green arrow: swollen mitochondria; blue arrows: expanded endoplasmia.

圖4各組大鼠肝組織透射電子顯微鏡觀察

5 各組大鼠肝脂含量變化

與正常組相比較，模型組肝組織勻漿中TC和TG含量水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，小檗堿組肝組織勻漿中TC和TG含量水平顯著下降(P<0.05或P<0.01)，見圖5。

Figure 5.The levels of TC and TG in the liver of rats. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsnormal group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsmodel group.

圖5各組大鼠肝組織TC和TG水平

6 各組大鼠肝組織SOD活性、MDA含量和T-AOC的變化

與正常組比較，模型組肝組織勻漿中MDA的水平顯著升高，而SOD活性和T-AOC顯著降低(P<0.01)；小檗堿組與模型組相比，肝組織勻漿中MDA的水平顯著降低而SOD活性和T-AOC顯著升高(P<0.01)，見表1。

表1 肝組織SOD活性、MDA含量及T-AOC水平變化的比較

**P<0.01vsnormal group;▲▲P<0.01vsmodel group.

7 各組大鼠肝組織SIRT1/p53通路相關(guān)蛋白的變化

與正常組相比，模型組大鼠肝組織SIRT1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，而Ac-p53相對(duì)表達(dá)量顯著上升(P<0.01)；與模型組相比，小檗堿組大鼠肝組織SIRT1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，而Ac-p53相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P<0.01)。3組間的總p53相對(duì)表達(dá)量沒有顯著差異,見圖6。

Figure 6.The expression levels of SIRT1, p53 and Ac-p53 proteins in liver tissues of rats. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsmodel group.

圖6各組大鼠肝組織SIRT1、p53和Ac-p53蛋白表達(dá)水平

討 論

隨著多種新型檢查手段的發(fā)展與標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，無創(chuàng)診斷NAFLD的技術(shù)趨于成熟，但肝組織活檢仍然是NAFLD診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[10]。本研究通過組織病理觀察到模型組大鼠肝臟存在明顯的脂質(zhì)沉積；同時(shí)，模型組肝組織勻漿TC、TG的含量較正常組顯著升高，提示高脂飲食喂養(yǎng)大鼠16周成功誘導(dǎo)NAFLD動(dòng)物模型。

小檗堿是從黃連和黃柏等傳統(tǒng)中草藥中提取的一種的生物堿，臨床常用來治療濕熱蘊(yùn)結(jié)胃腸道等疾病。研究表明，小檗堿具有抗氧化、降低血脂和血糖等作用，還能作為保肝劑用于多種肝毒性因子誘導(dǎo)的肝臟疾病[11-14]。本研究表明，在小檗堿干預(yù)下，高脂飲食喂養(yǎng)大鼠肝臟的氧化損傷和脂質(zhì)蓄積狀態(tài)有顯著改善，對(duì)NAFLD的防治具有意義。

氧化應(yīng)激損傷是NAFLD發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[15]。研究表明，測(cè)定肝組織中SOD的活性以及MDA和T-AOC的含量可以反映肝臟氧化應(yīng)激損傷的程度[16-18]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠的肝組織勻漿中MDA的水平顯著升高，而SOD活性和T-AOC顯著降低，提示NAFLD大鼠肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重的氧化損傷狀況。而在小檗堿的干預(yù)下，NAFLD大鼠肝臟的SOD活性和T-AOC含量顯著增加，而MDA的含量顯著降低，提示小檗堿干預(yù)能提高NAFLD肝臟的抗氧化能力并改善肝臟的脂質(zhì)過氧化，從而減輕NAFLD肝臟的氧化損傷。SIRT1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性蛋白質(zhì)脫乙酰基酶，其能顯著降低機(jī)體內(nèi)活性氧的水平并改善在氧化應(yīng)激條件下細(xì)胞的存活狀態(tài)[19]。Ren等[20]研究指出，藍(lán)莓汁和雙歧桿菌可以上調(diào)SIRT1蛋白的表達(dá)從而增強(qiáng)NAFLD大鼠肝臟的抗氧化能力。腫瘤抑制因子p53在NAFLD的發(fā)病機(jī)制中或許扮演著重要的角色，其是SIRT1的去乙?；繕?biāo)之一，正常情況下通過MDM2介導(dǎo)的泛素化及降解途徑維持著低水平表達(dá)，在病理狀態(tài)下通過乙?；绒D(zhuǎn)錄修飾以表現(xiàn)其活性[21-22]。研究表明，p53抑制劑干預(yù)能抑制p53的轉(zhuǎn)錄從而減少由飲食引起的NAFLD小鼠肝臟的氧化損傷[4]。更有研究表明，SIRT1激活劑能提高SIRT1蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)對(duì)p53的去乙酰化來減輕細(xì)胞的凋亡活性[23]。結(jié)合我們的Western blot結(jié)果，小檗堿改善NAFLD大鼠肝臟的氧化損傷狀態(tài)可能通過上調(diào)SIRT1蛋白的表達(dá)，從而抑制p53的乙?；瘉韺?shí)現(xiàn)。

脂質(zhì)紊亂所引起的肝細(xì)胞脂肪變性也是NAFLD發(fā)病機(jī)制中的因素之一[24]。SIRT1能抑制脂肪合成與促進(jìn)脂肪酸β-氧化，是減輕NAFLD肝臟脂肪積蓄的潛在藥物靶點(diǎn)之一[25]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，肝臟特異性敲除SIRT1小鼠在普通飼料喂養(yǎng)的情況下，會(huì)出現(xiàn)肝臟脂肪性變[26]。臨床研究表明，NAFLD患者血清中SIRT1 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量比健康受試者明顯下降[27]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出高脂飲食喂養(yǎng)的SD大鼠肝臟SIRT1水平顯著下降的結(jié)論[28]。我們的結(jié)果也顯示，在高脂飼料喂養(yǎng)16周后，大鼠肝臟的脂肪積蓄較為嚴(yán)重，而且肝組織SIRT1蛋白表達(dá)顯著下降，而Ac-p53蛋白表達(dá)顯著上升。p53不僅與肝臟的氧化狀態(tài)有關(guān)，還能調(diào)控肝臟的脂質(zhì)代謝。Castro等[29]等研究指出，熊去氧膽酸可以通過上調(diào)體內(nèi)和原代大鼠肝細(xì)胞中SIRT1蛋白的表達(dá)從而降低Ac-p53的表達(dá)來改善NAFLD的嚴(yán)重程度。所以，通過調(diào)控SIRT1/p53通路，增強(qiáng)SIRT1蛋白的表達(dá)，降低p53的乙?；揭詼p弱其活性，是治療NAFLD的潛在機(jī)制與途徑之一。

本研究結(jié)果表明，小檗堿干預(yù)高脂飲食喂養(yǎng)大鼠16周后，大鼠肝臟的脂肪積蓄減輕，肝組織SIRT1蛋白表達(dá)顯著上升，而Ac-p53蛋白表達(dá)顯著下降。有研究指出，小檗堿能減輕高脂高糖喂養(yǎng)的普通C57BL/6小鼠肝臟脂肪變性，但是小檗堿的這種有益作用并沒有在同樣飲食情況下的SIRT1肝臟特異性敲除小鼠身上觀察到[30]，這表明SIRT1是小檗堿降脂作用的一個(gè)關(guān)鍵因素。結(jié)合本研究的結(jié)果，提示小檗堿通過上調(diào)SIRT1蛋白的表達(dá)，從而抑制p53的乙?；?，這可能是小檗堿干預(yù)減輕肝臟脂質(zhì)蓄積、治療NAFLD的機(jī)制之一。

綜上所述，小檗堿減輕高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝臟氧化損傷反應(yīng)和脂肪蓄積可能是通過調(diào)控SIRT1/p53通路來實(shí)現(xiàn)。