潘瑞金，楊 格，林佳慧，張楊賀,孫千惠，王醫(yī)術(shù)，楊曉霞*

(1.沈陽醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧 沈陽110000；2.吉林大學(xué) 病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春130021)

乳腺癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害女性健康和生命的一種最常見惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年全球約有49萬人死于該病[1]，我國乳腺癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。盡管在早期確診的乳腺癌患者中只有5%-10%出現(xiàn)遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移，但原發(fā)乳腺癌患者在切除原發(fā)腫瘤及輔助放化療治療后仍有很高幾率發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]。因此，尋找能夠準(zhǔn)確預(yù)測乳腺癌轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)記物，將可能為臨床上乳腺癌患者的治療提供幫助。

細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架的重新排列是腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)關(guān)鍵步驟。非肌細(xì)胞肌球蛋白II(NMII)是細(xì)胞骨架的重要組成部分并與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)，其由兩個(gè)肌球蛋白重鏈和兩對肌球蛋白輕鏈構(gòu)成。有研究表明非肌細(xì)胞肌球蛋白重鏈IIA(NMHCIIA )在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[3，4]。肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈(RLC)參與調(diào)節(jié)NMII的結(jié)構(gòu)與功能，RLC可以被肌球蛋白磷酸酶的調(diào)控亞基MYPT1(Myosin phosphatase target subunit 1)去磷酸化從而功能受到抑制。因此，MYPT1-RLC-NMHCIIA途徑可能在乳腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，探討此途徑與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系將可能為預(yù)測乳腺癌轉(zhuǎn)移提供新型生物標(biāo)記物，為乳腺癌患者的治療提供新的分子靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

篩選收集沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科2006年-2016年100例乳腺病例作為研究對象。年齡30-87之間。其中乳腺增生20例，乳腺纖維瘤20例，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌60例。

1.2 主要試劑

DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)，免疫組化SP試劑盒(北京索萊寶公司)，復(fù)合消化酶(南京建成公司)，兔抗人MYPT1多克隆抗體(Abcam公司)，兔抗人RLC多克隆抗體(Abcam公司)，兔抗人NMHCIIA單克隆抗體(Abcam公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組織化學(xué)按試劑盒說明書上要求操作，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，樹膠封片。

1.4 結(jié)果判定

組織細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒則判定為陽性表達(dá)，根據(jù)顏色深淺區(qū)分強(qiáng)陽性表達(dá)、弱陽性表達(dá)及陰性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 MYPT1、RLC及NMHCIIA在乳腺組織中的表達(dá)情況

通過免疫組織化學(xué)染色的方法分別在乳腺增生組織、乳腺纖維瘤組織及乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中檢測MYPT1、RLC及NMHCIIA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在乳腺增生、乳腺纖維腺瘤內(nèi)，MYPT1在腺管呈陽性表達(dá)，主要位于腺細(xì)胞的胞漿和胞膜。隨著疾病惡性程度的增高，MYPT1的陽性表達(dá)逐漸減弱(圖1)。在乳腺增生、乳腺纖維腺瘤內(nèi)，RLC在腺管呈強(qiáng)弱不等的表達(dá)，在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中RLC呈陽性表達(dá)，主要表達(dá)于癌細(xì)胞的胞漿中，間質(zhì)也有表達(dá)(圖2)。RLC在不同進(jìn)展乳腺組織中表達(dá)情況沒有顯著趨勢。在乳腺增生、乳腺纖維腺瘤內(nèi)，NMHCIIA主要表達(dá)在腺細(xì)胞胞漿中；在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中NMHCIIA呈陽性表達(dá)，主要表達(dá)于癌細(xì)胞的胞漿中，間質(zhì)也有表達(dá)。隨著疾病惡性程度的增高，NMHCIIA的陽性表達(dá)逐漸增強(qiáng)(圖3)。具體結(jié)果見表1。

2.2 MYPT1-RLC-NMHCIIA信號與乳腺癌惡性程度及轉(zhuǎn)移的關(guān)系

在乳腺增生組織、乳腺纖維瘤組織及乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中MYPT1的表達(dá)情況隨乳腺癌惡性程度的增加逐漸減弱，而NMHCIIA的表達(dá)則隨乳腺癌惡性程度的增加而逐漸增加。此結(jié)果表明MYPT1的表達(dá)水平與乳腺癌惡性程度呈負(fù)相關(guān)；而NMHCIIA的表達(dá)水平則與乳腺癌的惡性程度呈正相關(guān)。此外，根據(jù)我們收集的臨床資料顯示，具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例(n=27)，其病理切片中MYPT1往往低表達(dá)(P<0.05)，而RLC和NMHCIIA則表現(xiàn)為高表達(dá)情況(P<0.05)。

圖1 免疫組織化學(xué)染色觀察MYPT1在乳腺組織中的

圖2 免疫組織化學(xué)染色觀察RLC在乳腺組織中的

圖3 免疫組織化學(xué)染色觀察NMHCIIA在乳腺組織中的

病變類型nMYPT1+陽性率(%)RLC+陽性率(%)NMHCIIA+陽性率(%)乳腺腺病171588.2423.5741.1乳腺腺瘤181688.9844.4527.7乳腺腺癌523567.32446.13363.5

3 討論

我們的研究結(jié)果顯示，惡性程度越高的乳腺癌樣本中MYPT1的表達(dá)越低，此結(jié)果提示MYPT1在乳腺癌中可能發(fā)揮抗腫瘤作用。MYPT1是肌球蛋白磷酸酶的調(diào)控亞基，它可以催化肌球蛋白輕鏈的去磷酸化，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，如平滑肌的收縮[5-7]。細(xì)胞運(yùn)動(dòng)是腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的重要條件，調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的信號必然在乳腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。因此，MYPT1可能參與調(diào)控乳腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。但近年來關(guān)于MYPT1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的相關(guān)研究較少，而關(guān)于MYPT1抗腫瘤作用的具體機(jī)制尚不清楚。有研究表明，在前列腺癌中MYPT1可以抑制血管生成并可有效改善前列腺病人的不良預(yù)后[8]。MYPT1還可通過對RhoA磷酸化的抑制作用抑制胃癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移活性[9]。目前尚未有研究證明MYPT1通過RLC-NMHCIIA途徑參與乳腺癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控。

有研究表明，RLC是重要的腫瘤標(biāo)記性分子。RLC的磷酸化在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10-14]，RLC受多種途徑調(diào)節(jié)參與腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移的調(diào)控。NMHCIIA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用目前尚不明確，多項(xiàng)研究顯示，NMHCIIA的表達(dá)及其功能可以促進(jìn)多種類型腫瘤的進(jìn)程[15-18]，但也有研究顯示，在基因?qū)用鎸幋aNMHCIIA的基因myh9進(jìn)行處理后，確定myh9可以作為一種抑癌基因發(fā)揮作用[19]。

我們的研究結(jié)果顯示，RLC和NMHCIIA在惡性程度較高的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，表明其與乳腺癌的發(fā)展密切相關(guān)。此外，MYPT1-RLC-NMHCIIA的表達(dá)情況與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈顯著的相關(guān)性，據(jù)此我們推測MYPT1-RLC-NMHCIIA途徑可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)參與乳腺癌轉(zhuǎn)移調(diào)控，即在具有高轉(zhuǎn)移潛能的乳腺癌組織中，MYPT1表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致RLC磷酸化增加，促進(jìn)NMHCIIA的磷酸化，從而加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，促進(jìn)轉(zhuǎn)移。綜上，MYPT1-RLC-NMHCIIA信號可能是參與乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要信號途徑，此途徑中各信號分子表達(dá)水平的變化可能與乳腺癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)程密切相關(guān)。

基于上述分析，我們猜測以細(xì)胞運(yùn)動(dòng)調(diào)控信號分子MYPT1-RLC-NMHCIIA為靶點(diǎn)，更為深入的探討其在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用將有望為臨床上乳腺癌患者的治療提供幫助。