李 濤，宛迎春，周長玉*，蘇子源

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院)

全球平均每年有100萬人被診斷出患有結(jié)直腸癌[12]，結(jié)直腸癌存在的類型多樣，約40%的病例攜帶KRAS突變，10%為BRAF突變[3]。與野生型KRAS患者相比，突變的KRAS預示著不良的預后和生存，同時耐受抗表皮生長因子受體(EGFR)治療[4-6]。成熟的microRNAs (miRNAs)是內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)RNA分子，長度僅有18-25 bp，與目標mRNA 3’UTR相結(jié)合，負向調(diào)節(jié)其翻譯[7]。miRNAs已被廣泛證實可以調(diào)控基礎細胞過程，如增殖，分化，發(fā)育，細胞凋亡和細胞周期[8]。本課題擬通過體外實驗明確自體吞噬在miR-155誘導結(jié)腸癌細胞死亡和凋亡中的作用，為臨床治療結(jié)腸癌提供新的策略和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人結(jié)腸癌HCT116，SW480，HT-29細胞和人結(jié)腸上皮細胞NCM460購買于中國科學院細胞庫。細胞培養(yǎng)用胎牛血清FBS和DMEM高糖培養(yǎng)液購買于美國GIBCO公司，1640培養(yǎng)液和細胞消化用胰酶購買于美國Hyclone 公司。miR-155 inhibitor和對照購買自上海吉瑪制藥技術有限公司，自噬抑制劑3-MA購買自美國Sigma公司，LC3和Cleaved caspase-3抗體購買自美國CST公司。

1.2 RT-qPCR

利用Trizol試劑方法提取細胞中總RNA，提取總RNA后利用TaqMan進行實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(RT-PCR)，miR-155所用引物和內(nèi)源性對照U6購買自上海吉瑪制藥技術有限公司，利用ABI 7300檢測系統(tǒng)對結(jié)果進行檢測。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

利用lipofectamine3000進行細胞轉(zhuǎn)染，細胞培養(yǎng)至80%進行細胞轉(zhuǎn)染，將細胞培養(yǎng)液換成Opti-MEM培養(yǎng)液，利用Opti-MEM稀釋lip3000和DNA，同時在DNA溶解液中加入P3000，室溫孵育10分鐘，滴入已經(jīng)換成Opti-MEM的平皿中，轉(zhuǎn)染5小時后，換成正常細胞培養(yǎng)液，24小時后進行相應實驗。

1.4 CCK8檢測結(jié)腸癌細胞存活率

細胞生長至對數(shù)生長期后，進行細胞傳代，計數(shù)，鋪96孔板，按照每孔5000個細胞進行鋪板，鋪板后過夜等待細胞完全貼壁后進行不同分組作用。按照不同的分組作用細胞，觀察細胞狀態(tài)完成相應的作用，待作用時間完成后，每孔加入10 μl CCK8溶液，輕輕混勻，放入浮箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3小時后停止作用，利用酶標儀檢測吸光度值(OD值，450 nm)。

1.5 Western Blotting檢測結(jié)腸癌細胞內(nèi)蛋白表達

蛋白是細胞內(nèi)發(fā)揮生物學功能的大分子物質(zhì)，檢測蛋白水平的改變可以反應細胞內(nèi)一些現(xiàn)象的發(fā)生，細胞蛋白提取和表達檢測步驟如下，將對數(shù)生長期的細胞按照分組進行分皿，待細胞完全貼壁后進行相應的處理，處理完成后進行蛋白的提取，棄除細胞正常培養(yǎng)液，冷卻的PBS洗細胞2次后，完全吸出PBS，加入150 μl RIPA細胞裂解液，均勻鋪開后，放置冰上作用5分鐘后，利用細胞刮將細胞完全刮除后轉(zhuǎn)至EP管中，放入4℃冰箱搖勻作用30分鐘，3 000 rpm/min離心20 min，取上清后對蛋白濃度進行定量(BCA方法)。根據(jù)蛋白濃度絕對上樣體積，蛋白中加入loading buffer，95℃煮蛋白使其變性后，進行蛋白質(zhì)丙烯酰胺凝膠電泳分離不同分子量的蛋白，將膠上的蛋白通過轉(zhuǎn)模轉(zhuǎn)移至PVDF膜上， 5%脫脂奶粉中封閉2小時，根據(jù)檢測蛋白的不同加入相應的一抗，低溫孵育過夜，第二天PBST清膜3次后加入相應的二抗，室溫孵育2小時后， PBST清膜3次， ECL發(fā)光顯示，對結(jié)果進行拍照分析。

1.6 流式細胞儀檢測不同分組結(jié)腸癌細胞凋亡率

利用流式細胞術檢測不同分組下結(jié)腸癌細胞的凋亡率，利用Annexin V-FITC/PI雙染色檢測凋亡率的改變。具體步驟如下，將對數(shù)生長期的細胞按照分組進行分皿，待細胞完全貼壁后進行相應的處理，藥物作用完成后，消化收集細胞，利用冷PBS清洗細胞2次后加入染料Annexin V-FITC和PI溶液，避光作用半個小時，利用流式細胞術進行熒光強度的檢測。

1.7 統(tǒng)計學方法

利用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行分析，兩組比較采用t檢驗的方法，三組及三組以上采用方差分析的方法，P<0.05定義為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人正常結(jié)腸上皮細胞與結(jié)腸癌細胞miR-155表達水平

為明確miR-155在人正常結(jié)腸上皮細胞(NCM460)和結(jié)腸癌細胞(SW480，HCT-116，HT-29)中表達的差異，我們首先利用了RT-qPCR的方法檢測了細胞中miR-155表達水平，結(jié)果顯示，與正常結(jié)腸上皮細胞相比，不同種類的結(jié)腸癌細胞都呈現(xiàn)出了miR-155表達水平的升高，差異具有統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2 miR-155 inhibitor對結(jié)腸癌細胞存活率的影響

在檢測到miR-155表達水平上調(diào)的基礎上，我們進一步探討抑制miR-155對結(jié)腸癌細胞生物學行為的影響，我們首先檢測了SW480細胞存活率的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑可以明顯的降低SW480細胞存活率，差異具有統(tǒng)計學意義，見表2。

表1 RT-qPCR檢測不同細胞系中miR-155表達水平

*與NCM-460相比較有統(tǒng)計學差異，P<0.05

表2 miR-155 inhibitor對SW480細胞存活率的影響

*與Control組比較，P<0.05

2.3 miR-155 inhibitor對結(jié)腸癌細胞凋亡的影響

在檢測miR-155 inhibitor對結(jié)腸癌細胞存活率影響的基礎上，我們進一步檢測了其對凋亡率的影響，我們首先利用流式細胞術的方法檢測了給予miR-155 inhibitor對凋亡率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比較，miR-155 inhibitor可以明顯的增加結(jié)腸癌細胞的凋亡率，差異具有統(tǒng)計學意義，結(jié)果見表3。為明確細胞中凋亡的改變，我們利用Western Blotting的方法進一步檢測了結(jié)腸癌細胞中凋亡相關蛋白的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予miR-155 inhibitor可以明顯的增加細胞中cleaved caspase-3表達，結(jié)果見圖1。

表3 miR-155 inhibitor對SW480細胞凋亡率的影響

*與Control組比較，P<0.05

圖1 miR-155 inhibitor對SW480細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響

2.4 miR-155 inhibitor對結(jié)腸癌細胞自噬的影響

研究顯示，自噬在mircroRNA與腫瘤之間的關系中發(fā)揮著重要的作用，因此我們進一步檢測了自噬相關蛋白的改變。Western Blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予miR-155 inhibitor可以明顯的增加細胞中自噬相關蛋白LC3-II表達，結(jié)果見圖2。

圖2 miR-155 inhibitor對SW480細胞LC3蛋白表達水平的影響

2.5 抑制自噬對miR-155 inhibitor引起的結(jié)腸癌細胞死亡的影響

為明確自噬在miR-155 inhibitor引起的結(jié)腸癌細胞死亡中的作用，我們給予細胞自噬抑制劑3-MA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制自噬可以進一步增加miR-155 inhibitor引起的細胞存活率的下降，差異具有統(tǒng)計學意義，結(jié)果見表4。

表4 抑制自噬對miR-155 inhibitor引起的 結(jié)腸癌細胞死亡的影響

*與Control組比較，P<0.05；#與miR-155 inhibitor組，P<0.05

2.6 抑制自噬對miR-155 inhibitor引起的結(jié)腸癌細胞凋亡的影響

我們進一步檢測了抑制自噬對miR-155 inhibitor引起的結(jié)腸癌細胞凋亡的影響，Western Blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制自噬可以進一步增加miR-155 inhibitor引起的cleaved caspase-3表達的增加，結(jié)果見圖3。

圖3 抑制自噬對miR-155 inhibitor引起的結(jié)腸癌細胞凋亡的影響

3 討論

結(jié)直腸癌是發(fā)達國家和發(fā)展中國家都非常常見的一種惡性消化系統(tǒng)腫瘤[9]。由于對結(jié)腸癌發(fā)病機制和分子調(diào)控認識的局限性，導致了目前治療效果的不佳[10]。因此，如何深入的了解結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展的過程，明確其分子調(diào)控機制，尋找新的有效的分子治療的靶點成為結(jié)腸癌研究的熱點和難點。越來越多的證據(jù)表明小分子RNA(miRNAs)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，其通過靶向調(diào)節(jié)與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的基因的表達，參與腫瘤的調(diào)控[11]。研究顯示，miR-155在多種癌癥中都呈現(xiàn)出了高表達，其促進了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展；同時，在腫瘤的診斷和預后中也發(fā)揮了重要的作用[12]。但是，miR-155與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展之間的關系報道較少，其對結(jié)腸癌細胞生物學行為的調(diào)控還不是很清楚。

我們首先檢測了正常結(jié)腸上皮細胞和結(jié)腸癌細胞中miR-155表達水平，發(fā)現(xiàn)不同結(jié)腸癌細胞中都呈現(xiàn)出了明顯的miR-155表達水平的升高。我們進一步檢測了其對細胞存活和凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制miR-155可以引起結(jié)腸癌細胞存活率的下降和凋亡率的上升。提示出，miR-155參與了結(jié)腸癌細胞生物學行為的調(diào)控。

自體吞噬是細胞內(nèi)普遍的過程，通過自噬體和溶酶體的融合清除不必要的細胞內(nèi)氨基酸、脂肪酸和核苷酸。多種不利的條件都可以導致自噬的發(fā)生，包括營養(yǎng)缺乏，缺氧，DNA損傷，或活性氧(ROS)的產(chǎn)生，通過自噬過程，降解不需要的細胞器以及蛋白質(zhì)，脂肪酸等物質(zhì)，從而維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和生存[13]。自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著雙重作用。在腫瘤發(fā)生的早期階段，它具有很強的抑制腫瘤發(fā)生的作用。通過抑制組織損傷，炎癥和基因組不穩(wěn)定來防止腫瘤的發(fā)生[14]。相比之下,一旦腫瘤在生長，自噬促進其生長、代謝，因為它能讓癌細胞克服細胞內(nèi)和環(huán)境壓力[15]。

為明確miR-155對結(jié)腸癌細胞自噬的影響以及自噬在miR-155 inhibitor引起細胞毒性中的作用，我們展開了進一步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-155 inhibitor可以促進結(jié)腸癌細胞自噬的發(fā)生，抑制自噬可以明顯的增加miR-155 inhibitor引起的細胞存活率的下降和凋亡的升高，提示自噬在miR-155 inhibitor誘導細胞毒性中起保護作用。

綜上所述，miR-155在結(jié)腸癌細胞中呈現(xiàn)高表達，抑制miR-155可以引起結(jié)腸癌細胞存活率的下降和凋亡的升高，聯(lián)合自噬抑制劑可以進一步增加細胞毒性。本課題為臨床治療結(jié)腸癌提供了新的靶點和聯(lián)合用藥策略。