曹 劍,張麗敏

(赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古 赤峰024000)

本實(shí)驗(yàn)制作小鼠周圍神經(jīng)損傷模型，應(yīng)用熊果酸(ursolic acid,UA)進(jìn)行干預(yù),觀察神經(jīng)損傷后PSD95蛋白表達(dá)的變化及髓鞘的形態(tài)學(xué)變化，分析二者的相關(guān)性，探討神經(jīng)損傷后熊果酸對(duì)損傷后修復(fù)與再生的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組

選用BALB/c鼠做動(dòng)物模型，共320只 (成年健康雄性，20±2 g,赤峰學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，坐骨神經(jīng)損傷模型制作后，隨機(jī)進(jìn)行分組，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型分為4組，分別是，熊果酸高、中、低劑量干預(yù)組和空白對(duì)照組；每組再根據(jù)神經(jīng)損傷后時(shí)間，隨機(jī)分為8組，分別為：12小時(shí)，1天，3天，5天、1周、2周，4周，8周，每組隨機(jī)分配10只。飼養(yǎng)條件：室溫,普通飲食。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模

神經(jīng)損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c鼠，應(yīng)用硫噴妥鈉(1%濃度，100 mg/kg)進(jìn)行腹腔麻醉,麻醉成功后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物俯臥位固定于固定板上,雙下肢及會(huì)陰部脫毛，碘伏消毒，取單側(cè)下肢后方，坐骨神經(jīng)走行部位縱切口約1.5 cm,切開皮膚，顯露皮下梨狀肌下，于梨狀肌下顯露坐骨神經(jīng),隨后鈍性分離坐骨神經(jīng)主干,將神經(jīng)主干在坐骨結(jié)節(jié)下約0.5 cm處離斷,顯微鏡下吻合離斷的坐骨神經(jīng),將切口逐層縫合。

1.3 藥物干預(yù)

將神經(jīng)損傷模型動(dòng)物進(jìn)行腹腔給藥。給藥劑量參照臨床應(yīng)用熊果酸原藥劑量，進(jìn)行等效換算[1]，換算后數(shù)值作為熊果酸干預(yù)的中等劑量，高劑量組與低劑量組以中等劑量組等比數(shù)列計(jì)算確定。通過換算得出各組給藥量數(shù)值分別為：20 mg/kg/d，10 mg/kg/d，5 mg/kg/d。以生理鹽水溶解后按照換算劑量腹腔注射給藥。生理鹽水對(duì)照組給予同等體積生理鹽水腹腔注射。熊果酸連續(xù)干預(yù)1周。熊果酸純度：>99.6%(T) 購于四川德思特生物有限公司，型號(hào)：DX0019。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本取材及制備

將每組模型動(dòng)物在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取材，取材步驟如下： 1%硫噴妥鈉100 mg/kg腹腔麻醉后，在各時(shí)間點(diǎn)取各組模型動(dòng)物5只，以原切口切開皮膚，顯露坐骨神經(jīng)，切取坐骨神經(jīng)自吻合口向遠(yuǎn)近端延申約3 mm的神經(jīng)干(全長約6 mm)，將神經(jīng)標(biāo)本標(biāo)記后迅速浸置于液氮中備用。將每組剩余5只以上述方法切取坐骨神經(jīng)干6 mm，以10%中性甲醛進(jìn)行固定，72小時(shí)后將標(biāo)本經(jīng)酒精脫水后石蠟包埋備用。

1.5 標(biāo)本檢測(cè)方法

1.5.1神經(jīng)標(biāo)本PSD95的Real-time PCR檢測(cè) 檢測(cè)步驟如下：1)引物合成：設(shè)計(jì)PSD-95(Beacon designer 7軟件)、以GAPDH為引物(表1)，結(jié)果經(jīng)Blast檢索驗(yàn)證引物的特異性。2)取坐骨神經(jīng)損傷段組織標(biāo)本，應(yīng)用Trizol提取總RNA，并以提取的總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA庫。隨后以cDNA庫為模板,進(jìn)行PSD-95的PCR擴(kuò)增，在各個(gè)反應(yīng)體系中均加入GAPDH的一對(duì)引物作為PCR擴(kuò)增的內(nèi)參，反應(yīng)條件為：95℃ 30 s-58℃ 60 s-72℃ 60 s 共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

表1 PSD-95、GAPDH引物設(shè)計(jì)

1.5.2LFB髓鞘染色 將甲醛固定72小時(shí)后的神經(jīng)標(biāo)本經(jīng)酒精脫水，石蠟包埋后切片行HE染色。先進(jìn)行初步篩選，觀察髓鞘的結(jié)構(gòu)及神經(jīng)損傷處增生及恢復(fù)情況，通過初步篩選確定LFB染色對(duì)象。將初篩后的石蠟標(biāo)本切片脫蠟后，置入60℃ LFB液中浸泡12小時(shí)；隨后應(yīng)用95%酒精浸泡5分鐘；再加入0.05%碳酸鋰溶液靜置15 s；最后應(yīng)用70%的酒精進(jìn)行洗滌，再經(jīng)蒸餾水洗滌后脫水透明封片。

2 結(jié)果

2.1 Real time-PCR結(jié)果

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示：在正常BALB/c鼠神經(jīng)組織中PSD-95 mRNA僅有少量表達(dá),而在坐骨神經(jīng)損傷模型中,神經(jīng)損傷節(jié)段的組織中PSD-95 mRNA 的表達(dá)在神經(jīng)損傷的初期呈上升趨勢(shì),并且由神經(jīng)損傷后12 h-2 w周期中表現(xiàn)隨時(shí)間遞增的趨勢(shì),各模型組組間可見明顯差異，熊果酸高劑量組和中劑量組在各時(shí)間點(diǎn)的增加量均低于熊果酸低劑量和生理鹽水對(duì)照組。但是在2 w后PSD-95 mRNA的表達(dá)量在各劑量組中的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)(見圖1)。

圖1 神經(jīng)損傷后PSD-95的mRNA表達(dá)

2.2 神經(jīng)標(biāo)本髓鞘LFB染色結(jié)果

神經(jīng)標(biāo)本經(jīng)LFB快藍(lán)染色后，神經(jīng)髓鞘顏色表現(xiàn)為淺藍(lán)色，而神經(jīng)軸突透明無法著色，圖片背景顯示白色。造模后8周的篩選標(biāo)本染色結(jié)果顯示：熊果酸高劑量組(H組)和中劑量組(M組)的髓鞘形態(tài)呈規(guī)則排列，并且髓鞘厚度相對(duì)均勻；同時(shí)觀察到髓鞘的輪廓清晰，局部組織輕度增生；而熊果酸低劑量組(L組)髓鞘形態(tài)不規(guī)則且薄厚不均，髓鞘的輪廓可辨別，神經(jīng)束間結(jié)締組織增生明顯；生理鹽水對(duì)照組(B組)髓鞘形態(tài)不規(guī)則，局部可見大量纖維結(jié)締組織增生(見圖2)。

a.高劑量組.b.中劑量組 c.低劑量組 d.對(duì)照組

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型標(biāo)本有髓纖維平均直徑和有髓纖維數(shù)目測(cè)定

將各組動(dòng)物模型LFB染色標(biāo)本鏡下隨機(jī)選取視野進(jìn)行圖像分析，計(jì)算有髓神經(jīng)纖維的數(shù)目和平均直徑，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明,有髓神經(jīng)纖維的數(shù)量和直徑在高、中劑量組顯著高于低劑量組和模型組(P<0.05),表明高級(jí)神經(jīng)再生高、中劑量組神經(jīng)損傷后恢復(fù)情況優(yōu)于低劑量組和模型組(表2)。

表2 造模8周后各組有髓神經(jīng)纖維數(shù)目及其平均 直徑變化

綜上所述，坐骨神經(jīng)損傷模型中PSD-95 mRNA的變化與神經(jīng)髓鞘LFB染色的有髓神經(jīng)纖維數(shù)目及其平均直徑變化趨勢(shì)呈反比。

3 討論

熊果酸是三萜類化合物并以化合物的形式存在于許多天然植物中，有研究表明熊果酸具有抗炎、鎮(zhèn)靜以及降低血糖等功效；同時(shí)它還是一種抗氧化劑，在醫(yī)藥和化工領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[2]。UA的作用機(jī)理是：可以迅速降低ALT、GPT具有降黃疽、增進(jìn)食欲、緩解纖維化的作用，對(duì)肝功能的恢復(fù)具有調(diào)節(jié)作用。

當(dāng)UA濃度(5-15 μmol/L)時(shí)對(duì)抗谷氨酸受體激動(dòng)劑紅藻氨酸誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元自由 基形成、線粒體膜電位下降[3]。熊果酸作為一種強(qiáng)抗氧劑，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化- 還原平衡，減少氧化應(yīng)激造成的損傷，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。但目前，關(guān)于其對(duì)周圍神經(jīng)損傷后的保護(hù)性作用未見報(bào)道[4-7]。PSD95(突觸后密度蛋白，postsynaptic density protein 95)又稱為神經(jīng)骨架蛋白，可以反映突觸的形態(tài)和密度。PSD95的結(jié)構(gòu)由N 端3個(gè)重復(fù)的PDZ和SH3以及C 端的GK 結(jié)構(gòu)域三部分組成。其中PDZ 結(jié)構(gòu)域是其主要功能單元,能夠關(guān)聯(lián)和協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)間的功能域，使其特異地與離子通道和相關(guān)受體的靶點(diǎn)蛋白的C 端緊密結(jié)合。PSD-95 的第2 個(gè)PDZ 結(jié)構(gòu)域可以同時(shí)結(jié)合NMDA 受體中NR2B亞基C 端第7個(gè)氨基酸和一氧化氮合酶nNOS構(gòu)成NMDAR/PSD-95/nNOS三二聚體[8]。中間結(jié)構(gòu)域SH3則可以結(jié)合Ras 相關(guān)效應(yīng)器蛋白和肌動(dòng)，具有介導(dǎo)模體的作用。另一個(gè)GK 結(jié)構(gòu)域和酵母的胍氨酸激酶具有同源性[9]。有研究表明PSD-95可以關(guān)聯(lián)突觸后神經(jīng)元黏附分子neuroligins 和突觸前膜外伸蛋白neurexins，對(duì)突觸結(jié)構(gòu)連接和功能的表達(dá)具有正向調(diào)節(jié)作用。位于第二和第三個(gè)PDZ之間存在的殘基絲氨酸-295 對(duì)神經(jīng)元的突觸可塑性具有調(diào)控作用：絲氨酸-295 的磷酸化可以促進(jìn)PSD-95 的聚集并促進(jìn)突觸的長時(shí)程，相反絲氨酸-295的去磷酸化則抑制突觸的長時(shí)程[10]。有研究證實(shí)：PSD-95可以將膜蛋白穩(wěn)定在突觸水平，同時(shí)還可以調(diào)控膜蛋白的功能，NMDA 受體的門控通道具有PSD-95 劑量依賴性，與此同時(shí)PSD-95對(duì)鉀通道具有內(nèi)向聚集功效[11-14]。通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)： Real-time PCR的檢驗(yàn)結(jié)果表明在BALB/c鼠坐骨神經(jīng)損傷后，神經(jīng)損傷段的PSD-95被激活并大量表達(dá)，增加了局部的炎性反應(yīng)和瘢痕增生，抑制了神經(jīng)髓鞘的再生，應(yīng)用熊果酸后高中劑量組的PSD-95表達(dá)明顯低于于低劑量組及對(duì)照組。坐骨神經(jīng)損傷后應(yīng)用熊果酸可以對(duì)PSD-95的活化起到持續(xù)抑制作用,達(dá)到神經(jīng)損傷后的保護(hù)作用，為神經(jīng)的再生創(chuàng)造條件。

通訊作者簡(jiǎn)介：張麗敏，女，55歲，醫(yī)學(xué)碩士，法學(xué)碩士，教授，主任醫(yī)師，赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院院長，赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院院長，郵箱：zlm0476@163.com。