王亞?wèn)|,周 軍,孫學(xué)軍,尹家俊*

(1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 a.普通外科;b.介入科,遼寧 大連116001；2.西安交通大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普通外科)

原發(fā)性肝癌是世界上最常見(jiàn)且死亡率較高的惡性腫瘤之一,5年生存率約為17%,而晚期惡性腫瘤患者的生存率僅為3%[1-2]。手術(shù)切除是肝癌治療的首選方法,但由于肝癌早期癥狀不明顯導(dǎo)致大部分患者確診時(shí)已是晚期,錯(cuò)失了最佳的手術(shù)時(shí)機(jī),因此化學(xué)療法仍是中晚期肝癌患者治療的重要方法。索拉非尼是一種多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑,也是原發(fā)性肝癌臨床管理的一線藥物,然而腫瘤細(xì)胞耐藥性的出現(xiàn)及發(fā)展嚴(yán)重影響了肝癌的治療效果[3]。

近年來(lái),不斷有研究表明,二甲雙胍,一種雙胍類口服治療2型糖尿病的臨床藥物,在增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療敏感性方面發(fā)揮著重要性作用[4，5]。但是其在肝癌細(xì)胞化療敏感性方面的作用及相關(guān)機(jī)制依然未全部闡明。因此,本研究探究了二甲雙胍在肝癌細(xì)胞索拉菲尼敏感性方面的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青霉素/鏈霉素試劑及胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco；凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-FITC/PI)購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)；實(shí)驗(yàn)所用一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司,二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。二甲雙胍購(gòu)自大連美侖生物制藥有限公司,索拉菲尼由大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院提供。

1.1.2細(xì)胞 人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS及1%青霉素/鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中,并將其置于37℃,CO2含量為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)消化細(xì)胞進(jìn)行傳代。

1.2.2藥物處理 給予HepG2細(xì)胞0,1,5,10,50 μM的索拉菲尼分別處理0、24、48和72 h。此外,0,1,2,5,10 mM的二甲雙胍處理細(xì)胞0、24、48和72 h。

1.2.3蛋白免疫印跡(Western blot) 細(xì)胞收集或組織勻漿后加入蛋白裂解液,離心吸取上清為組織全蛋白溶液,BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,變性后取30 μg蛋白樣本經(jīng)10% SDS-PAGE膠進(jìn)行分離,轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜用5%牛奶進(jìn)行室溫封閉1 h,一抗4℃孵育過(guò)夜,二抗室溫孵育1 h,洗膜后ECL化學(xué)熒光顯色,ImageJ軟件進(jìn)行定量。 GAPDH為內(nèi)對(duì)照。

1.2.4CCK-8實(shí)驗(yàn) HepG2細(xì)胞按照4000個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)過(guò)夜,第二天給予細(xì)胞不同藥物濃度的索拉菲尼、二甲雙胍或索拉菲尼+二甲雙胍處理,于處理后的0、24、48和72 h分別向每孔中加入10 μl CCK-8溶液和90 μl細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)孵育 4 h,測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞,清洗一次,離心后每組加入 1×Annexin V Binding Buffer 100 μl,充分混勻細(xì)胞,每組細(xì)胞加入 5 μl FITC Annexin V 染液,5 μl PI 染液,避光室溫反應(yīng)15 min,然后每管加300 μl 1×Annexin V Binding Buffer溶液,1 h流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍增強(qiáng)索拉菲尼對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示,隨著藥物濃度的增強(qiáng)及作用時(shí)間的延長(zhǎng),索拉菲尼對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的抑制作用明顯提高(圖1A)；同樣地,5 mM及以上濃度的二甲雙胍亦可抑制HepG2細(xì)胞的增殖活性(圖1B)。由以上結(jié)果,我們最終選取了5 μM的索拉菲尼和5 mM的二甲雙胍做接下來(lái)的研究。同索拉菲尼組相比,二甲雙胍+索拉菲尼組細(xì)胞的增殖活性明顯降低(圖1C)。

A-B.CCK-8檢測(cè)不同濃度二甲雙胍或索拉菲尼對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的影響(*P<0.05,**P<0.01)；C.CCK-8檢測(cè)對(duì)照組、索拉菲尼(5 μM)組及索拉菲尼(5 μM) + 二甲雙胍(5 mM)組HepG2細(xì)胞的增殖活性(*P<0.05,索拉菲尼組vs對(duì)照組；#P<0.05,索拉菲尼+二甲雙胍組vs索拉菲尼組)。

圖1 二甲雙胍增強(qiáng)索拉菲尼對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 二甲雙胍增強(qiáng)索拉菲尼對(duì)HepG2細(xì)胞的促凋亡作用藥物處理48 h后收集細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,同索拉菲尼組相比,二甲雙胍+索拉菲尼組細(xì)胞凋亡明顯升高(圖2A)；此外,western blot結(jié)果顯示,二甲雙胍+索拉菲尼組Bcl-2表達(dá)降低,而caspase3和Bax表達(dá)升高(圖2B)。

2.3 二甲雙胍抑制HepG2細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化Western blot結(jié)果顯示,同索拉菲尼組相比,二甲雙胍+索拉菲尼組細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)升高,而N-cadherin、Snail、Vimentin蛋白表達(dá)降低(圖3),表明二甲雙胍可抑制HepG2細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

2.4 二甲雙胍抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活同索拉菲尼組相比,二甲雙胍+索拉菲尼組細(xì)胞中PI3K、AKT和mTOR的磷酸化蛋白的表達(dá)降低(p-PI3K、p-AKT、p-mTOR),而總蛋白表達(dá)水平不變(圖4)。

A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各對(duì)照組、索拉菲尼組及索拉菲尼+二甲雙胍組HepG2細(xì)胞的凋亡情況；B.Western blot檢測(cè)各處理組HepG2細(xì)胞中Bcl-2、Bax及caspase3蛋白的表達(dá)情況。(*P<0.05,索拉菲尼組vs對(duì)照組；#P<0.05,索拉菲尼+二甲雙胍組vs索拉菲尼組)

圖2二甲雙胍增強(qiáng)索拉菲尼對(duì)HepG2細(xì)胞的促凋亡作用。

Western blot檢測(cè)各處理組HepG2細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Snail及Vimentin蛋白的表達(dá)(*P<0.05,索拉菲尼組vs對(duì)照組；#P<0.05,索拉菲尼+二甲雙胍組vs索拉菲尼組)。

圖3 二甲雙胍抑制HepG2細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

Western blot檢測(cè)各處理組HepG2細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR總蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá)(*P<0.05,索拉菲尼組vs對(duì)照組；#P<0.05,索拉菲尼+二甲雙胍組vs索拉菲尼組)。

圖4 二甲雙胍抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活。

3 討論

二甲雙胍作為2型糖尿病的一線治療藥物,除了具有胰島素增敏、降血壓等作用,近年來(lái)研究表明其可以降低糖尿患者罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)并改善肝癌患者的預(yù)后[6]。二甲雙胍亦可明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖活性并促進(jìn)其凋亡[7-9]。此外,越來(lái)越多的證據(jù)表明二甲雙胍可提高腫瘤細(xì)胞的化療敏感性。例如,吳詩(shī)文等[10]研究表明,在胃癌中,采用二甲雙胍聯(lián)合順鉑處理較單一順鉑處理細(xì)胞增殖活性受到明顯抑制。Uehara[11]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,二甲雙胍能明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖并提高其對(duì)順鉑的化療敏感性。同樣地,在下咽癌[12]、結(jié)腸癌[13]、胰腺癌[14]等惡性腫瘤中,二甲雙胍聯(lián)合化療藥物用藥亦可明顯增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性。在本研究中,我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探究了二甲雙胍對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2化療敏感性的影響,我們發(fā)現(xiàn),同索拉菲尼單獨(dú)處理組相比,二甲雙胍聯(lián)合索拉菲尼用藥可促進(jìn)促凋亡蛋白Bcl-2和caspase3的表達(dá),降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡且抑制細(xì)胞增殖活性,以上結(jié)果揭示了二甲雙胍同樣可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的敏感性。

為了探究二甲雙胍誘導(dǎo)化療敏感性的相關(guān)機(jī)制,我們通過(guò)western blot技術(shù)檢測(cè)了二甲雙胍對(duì)上皮間充質(zhì)進(jìn)程的影響,我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍處理可明顯降低N-cadherin、Snail及Vimentin等間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記分子,而提高上皮細(xì)胞標(biāo)記分子E-cadherin的表達(dá),表明二甲雙胍可干預(yù)肝癌細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程。此外,我們亦探究了二甲雙胍對(duì)PI3K/AKT/mTOR通路激活的影響,結(jié)果顯示二甲雙胍處理后HepG2細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT及p-mTOR的表達(dá)水平均顯著降低,而總蛋白無(wú)明顯變化,表明二甲雙胍可抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活,這或許介導(dǎo)了二甲雙胍對(duì)肝癌細(xì)胞化療敏感性的提高。二甲雙胍是能量調(diào)控信號(hào)分子腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的激動(dòng)劑,激活A(yù)MPK可抑制下游哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡等生命進(jìn)程。激活的PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可通過(guò)提高促癌基因缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,HIF)、cyclin D及c-myc等的轉(zhuǎn)錄和翻譯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,抑制凋亡,因此,特異性調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活已成為癌癥治療的重要靶標(biāo)[15]。

綜上,本研究表明二甲雙胍能夠明顯增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的藥物敏感性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖活性,這可能與PI3K/AKT/mTOR通路和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程的抑制相關(guān)。