宋喚春 葉素紅 王凱旋 仝淑花?

癲癇是最常見而嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)現(xiàn)有＞900萬(wàn)癲癇患者，患病率達(dá)7‰，且以每年新發(fā)40～60萬(wàn)例的速度遞增［1］。使用抗癲癇藥物是主要的治療方法，拉莫三嗪（LTG）作為第二代廣譜抗癲癇藥物，是復(fù)雜部分性發(fā)作的首選藥物，對(duì)于特發(fā)性全面性癲癇丙戊酸治療失敗后的全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作，拉莫三嗪亦為首選藥物［2］。LTG穩(wěn)態(tài)時(shí)最高血藥濃度個(gè)體差異性大，血藥濃度易受其他合并用抗癲癇藥物影響，皮疹發(fā)生率高且不能預(yù)測(cè)是否嚴(yán)重危害生命［3-6］。LTG血藥濃度的監(jiān)測(cè)利于優(yōu)化LTG給藥劑量實(shí)現(xiàn)個(gè)體化給藥，并能有效避免不良反應(yīng)發(fā)生。作者應(yīng)用高效液相色譜檢測(cè)LTG血藥濃度，并對(duì)其影響因素進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)（G1322A在線脫氣機(jī)，G1311C泵，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1315D DAD檢測(cè)器和Chem32工作站）；電子天平（Mettler Toleto ML204/02）；超聲波清洗機(jī)（JP-100/S 機(jī)械-數(shù)碼）；離心機(jī)（xiang yi H-1650R）；氮吹儀（天津艾維歐PHC-010）。

1.2 藥品與試劑 LTG對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：100775-200401）；非那西丁對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，IS，中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：100095-198904）； 乙 腈（Tedia. United states of America，AS1122-001，HPLC專用）；甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20110415，HPLC專用）：甲酸銨、三乙胺、硫酸鋅（分析純）；水為超純水并使用0.45μm濾膜再次過濾。40mM甲酸銨配制：稱取甲酸銨1.00g加入400ml超純水超聲溶解，0.45μm濾膜抽濾備用；0.25%三乙胺配制：量取200ml超純水，加入500μl三乙胺超聲混勻備用；5%ZnSO4-MeOH溶液配制：稱取1.00g ZnSO4加入20ml甲醇超聲溶解，因靜置24h便有沉淀析出，因此使用時(shí)需新鮮配制。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 （1）LTG標(biāo)準(zhǔn)液配制：精密稱取LTG對(duì)照品適量，置于25ml容量瓶中，用甲醇定容為500μg/ml儲(chǔ)備液。將LTG儲(chǔ)備液稀釋成1，2.5，5，10，25，50，100，250，500 μg/ml質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，儲(chǔ)備液及標(biāo)準(zhǔn)液儲(chǔ)存于4℃冰箱中。（2）內(nèi)標(biāo)溶液配制：精密稱取非那西丁對(duì)照品適量，置于25ml容量瓶中，用甲醇定容為1mg/ml儲(chǔ)備液，將非那西丁儲(chǔ)備液稀釋為100μg/ml內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液，儲(chǔ)備液及標(biāo)準(zhǔn)液儲(chǔ)存于4℃冰箱中。

1.4 LTG血藥濃度檢測(cè)方法的構(gòu)建 （1）色譜條件：色譜柱：Agilent Exlipse XDB-C18（4.6×150mm，5μm）；柱溫：25℃；流動(dòng)相比例：40mM/L甲酸銨-乙腈-0.25%三乙胺（70：20：10，V/V）；流速：1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～8.5min 306nm（LTG）；8.5～12min 250nm（內(nèi)標(biāo)）。（2）血漿樣本處理：精密吸取300μl血漿樣品置10ml玻璃具塞試管中，加入30μl內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液，渦旋10s，加入300μl蛋白沉淀劑（5%ZnSO4-MeOH），渦旋30s，加入2ml萃取液（乙酸乙酯：正己烷=4：1），繼續(xù)渦旋1min后，離心10min（4000r/min）后靜置1min，取其上清液置10ml尖頭玻璃離心管，水浴空氣吹干30min，甲醇200μl復(fù)溶，用0.45μm針筒式微孔濾膜濾過，濾液置高效液相色譜樣品瓶中，設(shè)置10μl進(jìn)樣。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及最低定量限測(cè)定：吸取270μl空白血漿置10ml玻璃具塞試管中，分別加入不同濃度LTG標(biāo)準(zhǔn)液使總體積為30μl，渦旋10s，使血藥濃度相當(dāng)于0.1，0.25，0.5，2.5，1，5，10，25，50μg/ml的血漿標(biāo)準(zhǔn)液，以不同濃度LTG血藥濃度峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai之比計(jì)算Y，以Y值為縱坐標(biāo)，LTG濃度X為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。（4）回收率測(cè)定：配制0.25，5，50μg/ml（低、中、高質(zhì)控濃度）LTG血漿標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定；配制0.25，5，50μg/ml（低、中、高質(zhì)控濃度）LTG甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定。血漿標(biāo)準(zhǔn)液與甲醇標(biāo)準(zhǔn)液峰面積比計(jì)算萃取回收率；將所測(cè)血漿標(biāo)準(zhǔn)液峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai之比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算LTG血藥濃度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算值與加入值之比計(jì)算方法回收率。精密吸取300μl空白血漿置10ml玻璃具塞試管中，加入30μl內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定記錄峰面積；精密吸取300μl甲醇溶液加入30μl內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定記錄峰面積。以血漿中內(nèi)標(biāo)峰面積與甲醇中內(nèi)標(biāo)峰面積之比計(jì)算內(nèi)標(biāo)提取回收率。（5）精密度測(cè)定：配制0.25，5，50μg/ml（低、中、高質(zhì)控濃度）LTG血漿標(biāo)準(zhǔn)液各10份，1d內(nèi)連續(xù)測(cè)定10次計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5d計(jì)算日間精密度。（6）穩(wěn)定性測(cè)定：配制0.25，5，50μg/ml（低、中、高質(zhì)控濃度）LTG血漿標(biāo)準(zhǔn)液，分為若干份，各濃度取1份處理后置進(jìn)樣器中，于0，1，6，12，24h進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)穩(wěn)定性；各濃度取5份存于4℃冰箱中，于1，2，3，5，7d進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算冷藏穩(wěn)定性；各濃度取6份存于-40℃冰箱中，于1，7，15，30，60，90 d進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算凍融穩(wěn)定性。

1.5 血漿與全血中LTG濃度比較 抽取患者靜脈血≥2ml置肝素試管送檢（以下簡(jiǎn)稱患者血樣）。本試驗(yàn)將患者血樣分為2份，一份渦旋混勻30s，取全血300μl待測(cè)，另一份離心10min（4000r/min）后取血漿300μl待測(cè)，兩份樣本處理后進(jìn)行測(cè)定。

1.6 常見抗癲癇藥物的干擾 將卡馬西平、奧卡西平、苯妥英鈉、丙戊酸鈉、托吡酯、地西泮、氯硝西泮、三唑侖、艾司唑侖、咪達(dá)唑侖共10種抗癲癇藥物加入到LTG血漿標(biāo)準(zhǔn)品中，處理后進(jìn)行測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。進(jìn)行雙側(cè)配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性與其他藥物干擾 本方法色譜系統(tǒng)條件下，LTG和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約7.2min和10.8min，專屬性實(shí)驗(yàn)表明LTG與內(nèi)標(biāo)峰分離良好，且不受血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不影響，干擾性試驗(yàn)表明LTG測(cè)定亦不受卡馬西平、奧卡西平、苯妥英鈉、丙戊酸鈉、托吡酯、地西泮、氯硝西泮、三唑侖、艾司唑侖、咪達(dá)唑侖等常見抗癲癇藥物的影響，色譜圖見圖1。

圖1 HPLC法測(cè)定LTG濃度色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限 LTG在0.1～50μg/ml范圍線性良好，直線回歸方程為Y=0.01785218X-0.0078585，相關(guān)系數(shù)r=0.9996。LTG定量下限為0.1μg/ml。

2.3 回收率 見表1。

表1 LTG提取回收率與相對(duì)回收率

2.4 精密度 LTG日內(nèi)日間精密度RSD均≤6.4%，見表2。

表2 LTG日內(nèi)與日間精密度

2.5 穩(wěn)定性 LTG血漿樣本處理后置進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)存放1日內(nèi)檢測(cè)RSD≤5.89；4℃冷藏1周內(nèi)檢測(cè)RSD≤6.14；-40℃保存3個(gè)月內(nèi)凍融后檢測(cè)RSD≤8.57，因此LTG樣本在此三種儲(chǔ)藏方式中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，可以滿足臨床樣本的檢測(cè)要求。

2.6 血漿與全血中LTG濃度比較 選取本院2015年4月份共20例患者血樣同時(shí)進(jìn)行血漿和全血中LTG濃度檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果經(jīng)雙側(cè)配對(duì)t檢驗(yàn)分析，配對(duì)t值為3.880，P值（雙側(cè)）＜0.01，血漿和全血中LTG濃度差值非0無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此同一血樣血漿和全血中LTG濃度無差別。見表3。

表3 LTG血漿中濃度與全血中濃度比較（μg/ml）

2.7 臨床應(yīng)用 收入本院2015年4月份使用拉莫三嗪片日給藥劑量為50～200 mg（符合拉莫三嗪片藥品說明書用法用量要求）患者30例，24例患者血漿LTG濃度在1～8μg/ml有效濃度范圍［4］內(nèi)，分別有3例患者血漿LTG濃度＜1μg/ml和＞8μg/ml。3例血漿LTG濃度＞8μg/ml患者均聯(lián)合使用丙戊酸鈉緩釋片，1例血漿LTG濃度＜1μg/ml患者合并使用卡馬西平片，可見丙戊酸鈉使LTG血漿濃度升高，而卡馬西平使LTG血漿濃度下降，與文獻(xiàn)［5，7-8］報(bào)道一致。服用不同日劑量拉莫三嗪片血漿LTG濃度分布情況。見表4。

表4 不同日劑量拉莫三嗪片血漿LTG濃度分布情況

3 討論

本研究以乙腈和水作為流動(dòng)相，加入甲酸銨、三乙胺有效改善色譜峰拖尾現(xiàn)象。流動(dòng)相中三乙胺濃度輕微變化極易引起PH變動(dòng)，影響色譜峰峰形，加入甲酸銨削弱了這種敏感性，配制流動(dòng)相時(shí)不需要PH計(jì)精確測(cè)定，簡(jiǎn)化配制過程。參照張杰等［9］血漿中LTG濃度檢測(cè)方法，采用非那西丁做為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（非那西丁為市場(chǎng)淘汰藥物），因不被患者所使用，不存在內(nèi)標(biāo)被干擾問題。LTG具有在190～250nm范圍及310nm處有較大紫外吸收的特性，但在190～250nm處不僅血漿中有較多雜質(zhì)具有紫外吸收較多常見并用藥物（卡馬西平、奧卡西平、苯妥英鈉等）也有較強(qiáng)紫外吸收，本研究采用310nm紫外吸收波長(zhǎng)檢測(cè)LTG，250nm波長(zhǎng)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)（非那西丁最大吸收），不受血漿雜質(zhì)及其他合用抗癲癇藥物影響。

本資料結(jié)果表明血漿和全血中LTG含量無差異方面存在漏洞，但提示在臨床血漿樣本量不足的情況下可以取全血進(jìn)行LTG含量測(cè)定，也提示血漿樣本存在溶血現(xiàn)象時(shí)不影響LTG含量測(cè)定。

本研究建立LTG血漿濃度檢測(cè)法不受卡馬西平、奧卡西平、苯妥英鈉、丙戊酸鈉、托吡酯、地西泮、氯硝西泮、三唑侖、艾司唑侖、咪達(dá)唑侖等常見抗癲癇藥物的干擾。本研究LTG血漿濃度HPLC測(cè)定方法應(yīng)用于臨床血藥濃度檢測(cè)，與多篇關(guān)于拉莫三嗪血藥濃度與療效關(guān)系的報(bào)道所提出的參考血藥濃度范圍相一致［4-8］。