劉永萍 劉雁 劉偉 沈瑤杰?

膿腫分枝桿菌復合群（MABC）屬于快速生長型非結(jié)核分枝桿菌（NTM）可廣泛引起人類致?。?］。MABC所引起的肺部感染等疾病癥狀與結(jié)核病非常相似，且MABC對一線抗結(jié)核藥物天然耐藥［2］。近年來，MABC引起人感染的報道越來越多，65%～80%的快速生長分枝桿菌（RGM）引起的NTM肺病主要是由 MABC感染導致的［3］。MABC主要是由膿腫分枝桿菌膿腫亞種（MAB），膿腫分枝桿菌馬賽亞種（MMA）和膿腫分枝桿菌bolletii亞種（MBO）3個菌種組成的復合群［4］。MABC的三個亞種對較多NTM抗菌藥物有不同的耐藥譜。研究認為其臨床致病特征及對抗生素的敏感度均存在差異［5］。因此，采用快速準確的進行MABC菌種鑒定明確區(qū)分三個亞種，對臨床診斷和治療有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 菌株標本為2012年1月至2015年12月杭州地區(qū)各結(jié)核病定點醫(yī)院上送至杭州疾控結(jié)防所行藥敏試驗的固體羅氏培養(yǎng)陽性菌株，經(jīng)對硝基苯甲酸/噻吩-羧酸酰肼（PNB/TCH）鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定為NTM的甘油保存菌株。結(jié)核分枝桿菌標準菌株（H37Rv ATCC27294）來自結(jié)防所實驗室保藏，胞內(nèi)分枝桿菌（ATCC13950）和膿腫分枝桿菌膿腫亞種（ATCC19977）購自美國ATCC公司，PNB/TCH鑒別培養(yǎng)基購自杭州創(chuàng)新生物有限公司，細菌基因組DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit. Cat.No.51304）購自德國Qiagen公司，PCR試劑（TaKaRa Ex Taq Kit. Code No. RR001A） 及 DNA Marker（100 bp DNA Ladder.Code No. 3422A）購自日本Takara公司，PCR引物合成及其他PBS，乙醇，甘油，電泳緩沖液，溶菌酶，瓊脂糖等常規(guī)試劑藥品均購自上海生工生物公司。

1.2 實驗方法 （1）分枝桿菌的培養(yǎng)及PNB/TCH表型鑒定：參照中國防癆協(xié)會《結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》［6］對來自杭州市基層結(jié)核病?？漆t(yī)院分離培養(yǎng)的分枝桿菌陽性菌株（即改良羅氏培養(yǎng)基上生長菌落）進行轉(zhuǎn)接，接種環(huán)挑取少量菌體至加有1ml PBS的磨菌管中研磨并靜置10min，取部分上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中加入適量PBS稀釋至0.5麥氏濁度。接著，用接種環(huán)沾一滿環(huán)接種至PNB/TCH培養(yǎng)基及對照管（改良羅氏培養(yǎng)基），最后根據(jù)菌落生長情況及數(shù)量判斷結(jié)果。（2）分枝桿菌基因組DNA提?。簩NB/TCH表型鑒定為NTM的菌株，挑取對照管羅氏培養(yǎng)基上生長的部分菌株轉(zhuǎn)移至加有1ml PBS離心管中混勻，85℃ 30min水浴滅活處理。離心棄去上層液體后，加入現(xiàn)配的溶菌酶37℃裂解＞2h，并按照Qiagen公司細菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟操作提取NTM菌株的基因組DNA，最終用200μl TE緩沖液洗脫后-20℃保存。（3）靶基因擴增：參考沈瑤杰等［7］文獻中16S rRNA、hsp65和rpoB三個基因的引物序列，合成引物并按其PCR反應體系和擴增程序分別擴增約1500 bp的16S rRNA，620 bp的hsp65和710 bp的rpoB基因。采用Primer premier 5軟件設(shè)計分枝桿菌16S-23S rRNA基因間隔區(qū)ITS序列的擴增引物，MITS-F ：5'-TTGTACACACCGCCCGTCA-3'（位于16S rRNA 1390-1408nt），MITS-R ：5'-TCTCGATGCCAAGGCATCCACC-3'（ 位 于 23S rRNA 23-44nt）。 對PCR擴增產(chǎn)物取部分進行2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測是否擴增到目的基因條帶。（4）序列測定及分析：經(jīng)凝膠電泳檢測合格的PCR產(chǎn)物直接送上海生工生物進行ABI 3730測序。序列經(jīng)SeqMan軟件與膿腫分枝桿菌標準菌株（ATCC19977）的16S rRNA基因584bp，hsp65基因441bp，rpoB基因360bp的標準序列進行比對并截取得到完整的各基因序列，將每條序列進行在線BLAST比對分析以確定相應菌株的菌種類型。（5）準確鑒定：對hsp65和rpoB測序結(jié)果不一致的菌株再加入ITS序列作為第4個靶基因進一步進行菌種鑒定。對編輯后的每一菌株的三個基因片段的準確序列進行串聯(lián)拼接得到16S rRNA +hsp65+rpoB的1385 bp基因序列，采用MEGA 5.0軟件的Neighbor-Joining法，以各標準菌株參考序列作為參照進行同源聚類分析，將親緣關(guān)系相近或成簇分布的菌株確定為同一類型菌種。

2 結(jié)果

2.1 PNB/TCH表型鑒定 參照中國防癆協(xié)會《結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》的判定規(guī)則，即在改良羅氏、對硝基苯甲酸、噻吩-羧酸酰肼鑒別培養(yǎng)基上均生長的為非結(jié)核分枝桿菌，在改良羅氏L-J、噻吩-羧酸酰肼鑒別培養(yǎng)基上生長而在硝基苯甲酸培養(yǎng)基上不生長的為結(jié)核分枝桿菌，對臨床分離菌株常規(guī)進行PNB/TCH的表型鑒別，作為分枝桿菌菌種的初步鑒定。

2.2 靶基因序列在線BLAST比對分析結(jié)果 將獲得的PCR產(chǎn)物序列經(jīng)BioEdit軟件查看序列峰圖，檢查測序結(jié)果是否合格，并用DNAstar SeqMan軟件與膿腫分枝桿菌膿腫亞種（ATCC19977）對應的靶基因（16S rRNA基因584 bp，hsp65基因441 bp和rpoB基因360 bp）的參考序列進行比對、剪切并保存所需片段的目的序列*.seq文檔。將每個樣品每個目的基因的準確序列提交至NCBI在線作同源性比對分析（見表1）。16S rRNA基因584 bp序列的BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)52株MABC的同源性高達100 %。hsp65基因441 bp的BLSAT比對分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)這52株MABC中有41株為MAB，9株為MMA以及2株MBO。rpoB基因360 bp的BLSAT比對分析結(jié)果則是44株MAB，6株MMA和2株MBO。兩個靶基因的測序結(jié)果中有5株MABC的鑒定結(jié)果是不一致的，編號為N02的菌株，hsp65和rpoB兩個基因的測序結(jié)果分別是MAB和MMA；編號為N39、N46、N47和N51這4個菌株，hsp6基因的測序結(jié)果是MMA，而rpoB基因的測序結(jié)果則均是MAB。對hsp65和rpoB兩個靶基因測序結(jié)果不一致的5個菌株進一步擴增ITS序列進行鑒定，比對分析結(jié)果均是MMA。故52株MABC的準確鑒定結(jié)果是40株MAB，10株MMA和2株MBO。

表1 52株MABC的表型及16S rRNA、hsp65、rpoB 和ITS測序鑒定結(jié)果

2.3 串聯(lián)序列的同源聚類分析結(jié)果 從GenBank下載各分枝桿菌標準株對應靶基因的參考序列，包括結(jié)核分枝桿菌標準株（H37Rv ATCC27294）、胞內(nèi)分枝桿菌（ATCC13950）、龜分枝桿菌（CIP104535）、膿腫分枝桿菌膿腫亞種（ATCC19977），膿腫分枝桿菌馬賽亞種（CIP108297），膿腫分枝桿菌 bolletii 亞種（CIP108541）。用MEGA 7.0軟件對靶基因16S rRNA、hsp65和rpoB的準確基因序列進行編輯、比對和校正，進一步采用Neighbor-Joining法對16S rRNA +hsp65+rpoB三個基因片段的串聯(lián)序列作系統(tǒng)進化樹分析，通過目的序列與標準參考序列的聚類分析確定膿腫分枝桿菌復合群各亞種的準確序列，實現(xiàn)親緣關(guān)系十分相近的NTM復合群及其亞種的準確鑒定。實驗菌株序列與標準菌株序列聚類成一簇的菌株被確定為該標準菌株的同一菌種，最后將52株MABC鑒定為40株MAB，10株MMA及2株MBO，結(jié)果與表1的準確鑒定結(jié)果一致。

3 討論

分枝桿菌屬包括結(jié)核分枝桿菌復合群（MTBC），麻風分枝桿菌及190多種NTM及其亞種［2］。NTM廣泛存在于自然界中，因其種類繁多，多為腐物寄生菌，僅少部分對人體致病且發(fā)病率較低，以往較少受到研究者的重視。MABC是可引起人類致病的重要非結(jié)核分枝桿菌，臨床分離NTM菌株中，MABC也是分離率最高耐藥性最強的RGM［7］。

傳統(tǒng)菌種鑒定方法耗時又費力且準確性差還不能鑒定到種，同時依賴于專業(yè)技術(shù)人員的觀察進行可靠結(jié)果的判定。近年來，基于分子生物學的菌種鑒定方法得到廣泛開展，提高細菌菌種鑒定的水平。PCR測序技術(shù)的迅速發(fā)展，對16S rRNA基因測序分析可將常規(guī)細菌鑒定至種的水平，現(xiàn)已成為鑒定菌種的金標準。同樣，分枝桿菌屬菌種鑒定中PCR測序的效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)生化鑒定，但16S rRNA基因測序鑒定的方法對高度同源的NTM菌種而言其鑒別能力有限，只能準確鑒定部分NTM至種的水平，對類似MABC等NTM中的復合群是無法進行準確區(qū)分的。本研究對PNB/TCH表型鑒定為NTM的菌種進行16S rRNA基因測序分析，可以將NTM初步鑒定至種的水平。對52株NTM，16S rRNA序列比對分析僅能將其鑒定為MABC，通過DNAstar軟件對序列分析發(fā)現(xiàn)52株膿腫分枝桿菌復合群的16S rRNA基因的序列同源性高達100 %，符合文獻報道的16S rRNA基因在分枝桿菌屬不同菌種間序列相似性為94.3%～100%［8］，即MABC的16S rRNA基因測序結(jié)果是完全一致的，故16S rRNA基因的測序分析無法進一步將MABC鑒定至亞種的水平。

用于菌種鑒定的靶基因既要求在不同的菌種間具有較高的序列保守性，可實現(xiàn)通用引物對不同菌種目標序列的擴增，又要求不同菌種的同源序列具有一定水平的差異，以實現(xiàn)鑒別區(qū)分的目的。綜合文獻報道，目前對于NTM的菌種鑒定常用的靶基因除了16S rRNA基因外主要還包括16S-23S rRNA基因間隔區(qū)（ITS）、RNA聚合酶β亞基（RNA polymerase subunit，rpoB）、熱休克蛋白 65（hot shock protein 65，hsp65）和DNA解旋酶（gyrA/gyrB）的編碼基因及sodA、recA等基因。僅就鑒別能力，hsp65優(yōu)于rpoB和ITS，16S rRNA基因的鑒別能力最低［9-10］。本研究在16S rRNA基因基礎(chǔ)上選取了hsp65和rpoB兩個靶基因分別對52株MABC進行進一步亞種鑒定，每個基因的BLAST比對結(jié)果雖然都能將MABC鑒定至亞種，但兩個基因的鑒定結(jié)果有9.6 %（5/52）的菌株不一致，進一步加測靶基因ITS序列的結(jié)果為MMA，故將這些不一致的菌株均確定為MMA。hsp65基因和rpoB基因雖已被主要用于鑒定MABC，但本研究發(fā)現(xiàn)這兩個基因在鑒別同源性非常近的MABC亞種時也是存在各自的局限性。因此單一的靶基因測序分析由于分辨能力不足無法將MABC等親緣關(guān)系相近的分枝桿菌或者復合群的亞種準確鑒別。

目前多采用多靶位基因測序［11］，將測序結(jié)果比對分析并相互驗證或?qū)⒍鄠€靶基因序列進行串聯(lián)并作聚類分析作為鑒定MABC的有效方法。對于多靶位基因測序鑒定結(jié)果不一致的現(xiàn)象，可通過增加多個靶基因，取多數(shù)基因鑒定一致的結(jié)果作為最終的準確鑒定結(jié)果。本研究通過串聯(lián)16S rRNA基因、hsp65和rpoB三個靶位基因的準確序列進行同源聚類分析，獲得的結(jié)果與16S rRNA基因、hsp65、rpoB和ITS四個靶基因測序的聯(lián)合分析鑒定結(jié)果一致。因此，在實際臨床檢驗中對分枝桿菌的鑒定，PNB/TCH表型鑒定為NTM的菌株經(jīng)16S rRNA基因測序發(fā)現(xiàn)為MABC的菌種可以進一步加測hsp65和rpoB甚至是ITS，進行多基因聯(lián)合分析鑒定，實現(xiàn)MABC亞種的快速、準確鑒定，必將有助于NTM肺病的精準診斷與治療。