陳捷 王志敏 陶曉曉 黃丹江 解晶

血管性認(rèn)知障礙（VCI）是一組包括由于血管因素導(dǎo)致的各種認(rèn)知障礙類型，其中包括無(wú)癡呆型血管性認(rèn)知障礙（VCI-ND）、血管性癡呆（VD）。研究認(rèn)為，腔隙性腦梗死（LI）可能是血管性癡呆的主要腦血管疾病類型之一。低氧誘導(dǎo)因子（HIF）在哺乳動(dòng)物體內(nèi)是一種非常重要的氧調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)許多低氧相關(guān)基因的表達(dá)。與腦梗死后發(fā)揮缺氧缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用密切相關(guān)。本研究在基因水平上觀察血管性認(rèn)知功能障礙患者M(jìn)RI參數(shù)變化及影響，探討HIF-1α基因多態(tài)性與LI患者血管性認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月至2017年5月本院收治的VCI患者68例。及同期正常體檢者50例。VCI-ND組43例，受教育程度：＜中學(xué)15例，≥中學(xué)28例。VD組25例：受教育程度：＜中學(xué)13例，≥中學(xué)12例。所有患者均符合美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病學(xué)與卒中研究所（NINDS）診斷標(biāo)準(zhǔn)及認(rèn)知功能障礙標(biāo)準(zhǔn)［1-2］。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他各個(gè)系統(tǒng)嚴(yán)重疾病，嚴(yán)重心臟疾病，嚴(yán)重各系統(tǒng)性感染，嚴(yán)重肝、腎功能不全，自身免疫學(xué)疾病，腫瘤等。（2）拒絕簽署知情同意書者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 方法 記錄所有患者一般資料（性別、年齡等）、家族情況。入院后統(tǒng)一由神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師采計(jì)算CMC評(píng)分；同時(shí)記錄其他心腦血管相關(guān)危險(xiǎn)因素，如吸煙史和高血壓、糖尿病、高尿酸血癥、同型半胱氨酸血癥等病史。所有患者均行MRI檢查及HIF-1α基因多態(tài)性檢測(cè)。

1.3 MRI檢查 應(yīng)用西門子Avanto的1.5T超導(dǎo)型磁共振成像掃描系統(tǒng)，梯度場(chǎng)強(qiáng)度40mT/m，梯度切換率150mT/m/ms，對(duì)所有受試者進(jìn)行頭部MR/平掃，包括Tl加權(quán)像、T2加權(quán)像、彌散加權(quán)像和液體衰減翻轉(zhuǎn)恢復(fù)序列（Flair像）。所有MRI數(shù)據(jù)由對(duì)該研究不知情的兩位副主任醫(yī)師以上影像學(xué)醫(yī)師進(jìn)行處理。如兩位影像學(xué)醫(yī)師對(duì)結(jié)果有異議，請(qǐng)第三位副主任醫(yī)師以上影像學(xué)醫(yī)師裁決。并進(jìn)行皮質(zhì)下白質(zhì)疏松評(píng)分及腔隙性腦梗死評(píng)分。

1.4 基因檢測(cè) 于入院次日清晨空腹留取5ml靜脈血提取DNA。HIF-1α基因SNP的選擇基因多態(tài)性的檢測(cè)，選取代表性的SNPs位點(diǎn)共4個(gè)（rs3783752，rs4899056，rs1957757，rs10873142）。 使 用 primer 5.0設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1），采用直接測(cè)序方法，讀取個(gè)體的基因型，所有基因檢測(cè)由華大基因公司完成。

表1 HIF基因SNPs位點(diǎn)分型所用引物及測(cè)序引物

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。危險(xiǎn)因素統(tǒng)計(jì)、認(rèn)知功能量表測(cè)定及MRI參數(shù)比較均分層比較，基因比較首先分正常組及VCI組比較，后將VCI組分層比較?；蛐托泄蠝夭衿胶鈾z驗(yàn)，計(jì)算基因型頻率；卡方檢驗(yàn)兩組間等位基因型頻率分布差異。block根據(jù) D'＞0.9以及 r2＞0.8進(jìn)行定義。頻率 ＜3% 單倍型被排除不再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。計(jì)算各SNP間連鎖不平衡程度。估算各單倍型頻率，比較正常組和VCI組間等位基因頻率和單倍型頻率的差異。

2 結(jié)果

2.1 危險(xiǎn)因素比較 見(jiàn)表2。

表2 各組受試者血管性危險(xiǎn)因素的比較［n（%）］

2.2 認(rèn)知功能評(píng)價(jià)及影像學(xué)比較 見(jiàn)表3。

表3 各組受試者認(rèn)知功能評(píng)分及MRI 檢查結(jié)果的比較［分，（x±s）］

2.3 正常組與VCI組HIF-1α基因多態(tài)性 見(jiàn)表4。

2.4 VCI組分層HIF-1α基因多態(tài)性 見(jiàn)表5。

2.5 連鎖不平衡分析 正常組連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)單倍型（rs3783752-rs4899056-rs1957757）高度連鎖（D'＞0.9，r2＞0.8），VCI組發(fā)現(xiàn)單倍型（rs3783752-rs1957757）高度連鎖，見(jiàn)圖1、2。

表4 兩組患者HIF-1α基因多位點(diǎn)基因型分布情況

表5 HIF-1α基因多位點(diǎn)基因型VCI組分層患者中的分布情況

圖1 正常組Linkage Disequilibrium分析

圖2 VCI組Linkage Disequilibrium分析

2.5 單倍體分析 見(jiàn)表6。

表6 HIF-1α基因多態(tài)性單倍體分析結(jié)果

2.6 VCI組HIF-1α基因多態(tài)性分層MRI評(píng)價(jià) 見(jiàn)表7。

表7 VCI組HIF-1α基因多態(tài)性分層MRI評(píng)價(jià)

3 討論

LI的發(fā)生機(jī)制通常由于顱內(nèi)深部的小穿通動(dòng)脈管壁發(fā)生梗阻性病變所致，約占所有缺血性腦血管病的25%［3］。LI由于臨床癥狀的低顯性易被忽視。結(jié)果顯示，LI不僅是缺血性腦血管病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)因素，同時(shí)也可能是導(dǎo)致血管性認(rèn)知功能障礙的重要危險(xiǎn)因素之一。Edwards等一項(xiàng)大樣本臨床隨機(jī)對(duì)照研究（1636例）發(fā)現(xiàn)［4］，約47%的LI患者存在輕度認(rèn)知功能損害。Makin［5］等Meta分析納入約7575名腦血管病患者，結(jié)果顯示2860名LI患者中約24%存在現(xiàn)認(rèn)知功能損害現(xiàn)象。

本資料對(duì)所有患者進(jìn)行危險(xiǎn)因素篩查，發(fā)現(xiàn)各組受試者年齡。性別。糖尿病病史比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而吸煙史、高血壓病史以及短暫性腦缺血發(fā)作和卒中史比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與既往研究相類似。而認(rèn)知功能評(píng)估及影像學(xué)比較，各組受試者M(jìn)MSE 評(píng)分。CCSE 評(píng)分和CMC評(píng)分比較及MRI 檢查測(cè)得的皮質(zhì)下白質(zhì)疏松和腔隙性腦梗死的評(píng)分比較均有顯著意義。VD人群的白質(zhì)疏松和腔隙性腦梗死評(píng)分均顯著高于VCI-ND人群及正常人群，研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果類似。MRI可以顯示腦白質(zhì)病變及特異性腦結(jié)構(gòu)評(píng)估表現(xiàn)正常的腦白質(zhì)區(qū)的功能。國(guó)外研究［6-7］顯示：腦白質(zhì)的完整性與認(rèn)知功能存在正相關(guān)性，腦白質(zhì)的損傷與MCI的發(fā)生也存在強(qiáng)相關(guān)性。

本資料對(duì)HI F-1α基因多態(tài)性四個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，將人群分類按照是否存在認(rèn)知功能障礙分成兩組，發(fā)現(xiàn)兩組rs4899056位點(diǎn)及rs10873142位點(diǎn)存在陽(yáng)性意義，其中，rs4899056基因位點(diǎn)VCI組TT基因型分布頻率較正常組低，rs10873142基因位點(diǎn)VCI組CC基因型分布頻率較正常組低。而將認(rèn)知功能障礙人群進(jìn)行分層分析，結(jié)果未見(jiàn)異常。同時(shí)基因連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，正常人群中發(fā)現(xiàn)單倍型（rs3783752-rs4899056-rs1957757）高度連鎖，異常組僅為發(fā)現(xiàn)單倍型（rs3783752-rs1957757）高度連鎖，基因單倍體分析，單倍型塊（rs3783752- rs4899056-rs1957757-rs10873142）ATTC，GCCC，GCCT單倍體基因型兩組有顯著差異，其中ATTC，GCCC均為保護(hù)因素，GCCT為危險(xiǎn)因素。但在各位點(diǎn)分層分析與MRI白質(zhì)疏松和腔隙性腦梗死評(píng)分，均未見(jiàn)異常。

腦梗死與缺血缺氧機(jī)制密切相關(guān)，目前研究較多的HIF，是一種非常重要的氧調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)許多低氧相關(guān)基因的表達(dá)［6］。HIF由α和β兩個(gè)亞基構(gòu)成，其中α亞基為調(diào)節(jié)亞基。HIF-1α亞基編碼基因位于人類染色體14q21-24，含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子。在HIF-1α基因內(nèi)SNP位點(diǎn)有諸如一下幾個(gè)位點(diǎn)：rs3783752、C111A、rs61755705、rs4899056、rsl957757、rsl0873142、rs41508050、rsll549465、rsll549467、rsl802821。在21%O2和7%O2環(huán)境中檢測(cè)活體中HIF-1αmRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下細(xì)胞內(nèi)HIF-1α mRNA分布廣泛并高表達(dá)。在缺氧條件下，α亞基能與β亞基結(jié)合，形成一個(gè)二聚體。HIF的形成與低氧應(yīng)答基因中的低氧應(yīng)答元件有關(guān)。介導(dǎo)缺氧基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，維持氧平衡的平衡。在缺血缺氧過(guò)程中，HIF-1α的羥化受到干擾，通過(guò)調(diào)整促凋亡蛋白Caspase 3靶基因表達(dá)。改善細(xì)胞能量代謝抑制凋亡。在氧糖剝奪（OGD）后，磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號(hào)通路可被激活。隨著缺血缺氧時(shí)間和程度的不同，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α也可通過(guò)誘導(dǎo)p53、Noxa、HGTDP，調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞毒作用調(diào)控細(xì)胞凋亡程度［7］。