馬華根，林華城，劉昭德，唐元瑜

（1 福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，2 福建中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，3 福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，4 福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院中醫(yī)基礎理論教研室，福州 350122）

平滑肌細胞，按其分布及特點，可分為血管平滑肌細胞和內(nèi)臟平滑肌細胞。其中血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）位于血管壁中膜，在維持管壁的完整性和調(diào)節(jié)血管的舒縮功能等方面起著重要作用[1]。VSMCs 是研究肺心病、高血壓病、心腦血管動脈粥樣硬化疾病、糖尿病血管病變，以及開展血管再生組織工程研究的重要載體和工具細胞。目前該細胞的原代培養(yǎng)方法，主要包括組織塊法和化學酶消化法：前者操作簡單，實驗成本低，但細胞培養(yǎng)周期長，且易混入較多雜細胞；后者雖然獲得的目的細胞純度較高，但操作過程繁瑣，細胞生長緩慢，所需試劑價格昂貴。課題組參考日本東京大學學者Kobayashi M 建立的方法[2]，并稍加改進。通過預實驗，在反復權衡上述兩種培養(yǎng)方法各自的利弊后，將二者結合，成功建立了一種高效、實用的VSMCs 原代培養(yǎng)方法。

材料和方法

1 實驗動物

6 ～8 周齡SD 大鼠2 只，雌雄不限，購自福建醫(yī)科大學實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證號為SCXK（閩）2016-0002。

2 主要試劑

胎牛血清（Gibco 公司，P161102ES），M199培養(yǎng)基（Gibco 公司，1839543），0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA 混合消化酶液（南京凱基生物公司，20170602），Trition X-100（Solarbio 公司，T8200），Ⅱ型膠原酶（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，461699），豬胰彈性蛋白酶（源葉生物公司，Y27J10J91591），α平滑肌肌動蛋白單克隆抗體（萬類生物科技有限責任公司，106280002），羊抗兔IgG—免疫組織化學試劑盒SABC 即用型（12F07A）、4%多聚甲醛（12D08A68）、DAB 顯色劑（12F08A22）均購自武漢博士德生物公司。

3 主要儀器

美國Thermo CO2恒溫培養(yǎng)箱，德國LEICA- DFC295 倒置生物顯微鏡，Airtech 超凈工作臺，湘儀TDZ4A-WS 低速離心機。

4 血管平滑肌細胞原代培養(yǎng)

在動物實驗中心，將受試大鼠頸椎脫臼處死，固定于解剖臺上，常規(guī)消毒后，剪開胸腹腔，充分暴露胸腹主動脈。從胸主動脈弓開始，小心剝離主動脈至骼總動脈分支處，用中號動脈夾夾閉兩端，剪取胸腹主動脈約4cm，迅速置于無菌離心管內(nèi)，帶回細胞室。在超凈臺內(nèi)，用眼科彎鑷將主動脈筋膜、脂肪及外膜依次徹底剝離后，用預冷的磷酸鹽緩沖液漂洗2～3 遍，以除去血凝塊。在無菌玻璃皿中將主動脈血管內(nèi)膜外翻，加入預熱的2mg/ml Ⅱ型膠原酶/彈性蛋白酶混合消化液6ml，37℃水浴振搖消化0.5h 后，用鋒利的無菌手術刀片來回刮除內(nèi)膜2～3 遍，繼續(xù)消化45min，離心，棄混合酶液。用虹膜剪將主動脈剪碎至米粒大小，加入含25%胎牛血清的M199 完全培養(yǎng)液4ml，吹打均勻，吸入培養(yǎng)瓶內(nèi)，輕緩作十字形晃動，使組織塊分布均勻，旋松瓶蓋，靜置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中，3～4d 后半量更換新鮮培養(yǎng)液。

5 血管平滑肌細胞傳代培養(yǎng)

待細胞進入對數(shù)生長期，吸棄舊培養(yǎng)基，用37℃預熱的PBS 液漂洗2 遍，然后加入4ml 0.25%胰蛋白酶／0.02%EDTA 室溫下消化2～3min，并輕微地間斷性敲擊振搖培養(yǎng)瓶底部，以促進細胞脫落。待大部分細胞圓縮時，加入4ml 完全培養(yǎng)基終止消化，離心，棄上清液，將細胞沉淀與6ml 培養(yǎng)液吹打混勻后，以1:2 的傳代比例接種，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6 形態(tài)學觀察

將接種有原代和第一代傳代VSMCs 的培養(yǎng)瓶置于倒置生物顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)、貼壁、密度及融合度等生長情況，并拍照記錄。

7 α 平滑肌肌動蛋白免疫細胞化學染色檢測

將原代大鼠VSMCs 消化成單細胞懸液后，接種于培養(yǎng)皿中，待其貼壁生長，融合度接近80%時進行鑒定。用PBS 輕緩漂洗5min×3 次，濾紙吸干殘存液；滴加預冷的4%多聚甲醛，覆蓋細胞表面，常溫固定15min；棄固定液，PBS 輕緩漂洗5min×3次，滴加0.3%Triton X-100，打孔透膜15min；傾倒透膜液，PBS 漂洗5min×3 次，滴加5%牛血清白蛋白，室溫封閉20min；棄封閉液，滴加1:250 α 平滑肌肌動蛋白單克隆抗體，將封口膜小心覆蓋于抗體液及細胞表面，置于濕盒中4℃孵育過夜；復溫，棄一抗，PBS 漂洗5min×3 次，滴加生物素化的羊抗兔IgG 抗體，37℃孵育30min；棄二抗，PBS 漂洗5min×3 次，滴加SABC，37℃孵育30min；PBS 漂洗5min×3 次，DAB 室溫顯色1～2min，漂洗后，于倒置顯微鏡下觀察，并拍照記錄。

結 果

倒置顯微鏡下觀察可見：接種于培養(yǎng)瓶中的血管組織塊培養(yǎng)48h 開始貼壁，72h 后細胞以組織塊為中心，向外遷移，“島嶼狀”細胞團初步形成（圖A，圖B）。96h 后原代細胞集落逐漸融合，鋪滿瓶底，呈現(xiàn)典型的“峰-谷”樣錯落生長（圖 C）。第一代傳代細胞形態(tài)基本保持不變，鏡下為三角形或星形（圖D，圖E）。免疫細胞化學SABC 法染色顯示，99%以上的第一代傳代細胞呈α 平滑肌肌動蛋白免疫反應陽性。免疫反應陽性產(chǎn)物定位于細胞質(zhì)，細胞核呈陰性（圖F）。

圖1 原代大鼠胸腹主動脈平滑肌細胞培養(yǎng)。A 和B，72h 原代島嶼狀細胞生長暈集落初形成；C，96h 原代細胞融合呈典型“峰-谷樣”錯落生長；D 和E，第一代傳代細胞形態(tài)保持不變，呈三角形或星形；F，第一代傳代細胞α 平滑肌肌動蛋白相關抗原免疫細胞化學染色表達陽性；比例尺：A，400μm；B—D，200μm；E，100μm；F，50μm Fig.1 Primary culture of rat thoracic and abdominal vascular smooth muscle cells. A and B, after 72h island-like primary cell outgrowth colonies formed preliminarily； C, after 96h the fusion of primary cells showed a typical “peak-valley-like”staggered growth； D and E, the morphology of passage 1 cells remained unchanged , which is triangular or astral； F, the passage 1 cells showed positive expression of α smooth muscle actin-associated antigen by immunocytochemistry； scale bar: 400μm in A, 200μm in B to D, 100μm in E and 50μm in F

討 論

有研究表明，異常增生的VSMCs 能大量合成膠原纖維、彈力纖維以及酸性粘多糖等基質(zhì)，而這些基質(zhì)是組成血管斑塊的重要成分。VSMCs 的異常增生和遷移是動脈粥樣硬化斑塊形成過程中的關鍵因素之一，是導致高血壓病、動脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病血管病變、腫瘤轉移，以及血管成形術后再狹窄等多種心血管疾病發(fā)生的重要細胞病理學基礎[3,4]。原代VSMCs 培養(yǎng)方法的成功建立，對于揭示相關疾病的病理變化機制有重要的學術奠基意義。

VSMCs 的原代培養(yǎng)方法，以酶消化法最為常用，而消化酶種類的選擇和運用，需結合該細胞所在的血管組織結構特點而定，這是平滑肌細胞能否體外培養(yǎng)成功的關鍵。主動脈為內(nèi)壁光滑、富有彈性的空腔樣器官，其管壁包括內(nèi)膜、中膜及外膜3 層結構：內(nèi)膜由內(nèi)皮、內(nèi)皮下層和內(nèi)彈性膜組成；中膜由平滑肌及豐富的彈性纖維、膠原纖維構成；外膜則為結締組織，與周圍的肌肉、脂肪相連。結合主動脈這一特殊的解剖結構，我們有針對性地選擇了粗制Ⅱ型膠原酶與彈性蛋白酶組成復合酶以加速血管中膜彈性纖維蛋白的溶解；同時還采用消化底物體積10 倍的酶液量充分裂解主動脈血管段，這與國內(nèi)學者使用單一的膠原酶[5,6]或膠原酶/胰蛋白酶混合酶[7,8]的消化效果相比，得到的細胞團塊更大，數(shù)量更多，細胞活性也更好，且能節(jié)約大量時間，最終提高了實驗效率。在消化結束后，將未消化完全的細小組織塊也接種到培養(yǎng)瓶中，并靜置培養(yǎng)3～4d，以增加細胞接種密度，縮短細胞生長的潛伏期，也有利于細胞提早進入對數(shù)生長期，從而加快細胞的分裂增殖速度。

此外，在原代培養(yǎng)過程中，VSMCs 的純化也是我們重視的問題之一。本實驗通過物理剔除法剝離外膜，以避免成纖維細胞的污染；同時通過銳利的手術刀片仔細刮除內(nèi)膜，避免內(nèi)皮細胞的污染；并以傳代為手段，利用目的細胞的群體優(yōu)勢，進一步純化VSMCs。實驗結果表明：細胞傳代融合后，在形態(tài)學上呈現(xiàn)出典型的“峰-谷”狀交錯生長，即細胞密集處與稀疏處相互交錯，“峰”為多層細胞丘，“谷”為稀疏排列的單層細胞[9]；同時結合α 平滑肌肌動蛋白免疫細胞化學染色檢測結果，陽性細胞率高達99%以上，據(jù)此可進一步證明所培養(yǎng)的目的細胞為純度較高的VSMCs。

總之，本實驗將酶消化法與組織塊法結合，成功培養(yǎng)出了大鼠胸腹VSMCs，并針對該細胞特有的生物抗原α 平滑肌肌動蛋白，應用免疫細胞化學染色方法，結合細胞形態(tài)學觀察，對所培養(yǎng)的目的細胞進行了鑒定。該方法簡便高效，實驗成本低，成功率高，值得推廣。