韋立志 廖作莊 楊斌 凌蘭興 王柳萍

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530007；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200)

通城虎，別名天然草、血萎、血藤暗消，收錄于《廣西中草藥》，主要分布于廣西的陸川、昭平、蒼梧等地，具有祛風(fēng)止痛，消腫解毒等多種功效[1-2]。臨床煎湯內(nèi)服應(yīng)用于胃脘痛，腹痛，小兒驚風(fēng)，咽喉炎等；外用搗敷可用于跌打損傷，風(fēng)濕骨痛，毒蛇咬傷等病癥，效果顯著，在民間得到普遍運(yùn)用[3]。然而，目前國內(nèi)外對(duì)通城虎研究極少，尤其對(duì)其藥效學(xué)研究和毒理學(xué)研究尚屬空白。因此，本研究對(duì)通城虎醇提物的腎毒性進(jìn)行探討，為民間和臨床安全用藥提供安全性指導(dǎo)，從而使通城虎得到更好的使用和推廣。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康的成年SD大鼠，雌雄各半，體重(230±20)g，大鼠及基礎(chǔ)飼料均由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證：SCXK桂2009-0005)。動(dòng)物飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物房為自然光照，溫度為20～22 ℃，相對(duì)濕度為40%～60%。給予大鼠自由進(jìn)食和飲水。

1.2藥物，試劑和儀器 通城虎藥材：由廣西市場(chǎng)上采集得到的廣西弄崗?fù)ǔ腔?。利福平：?guī)格0.15 g/粒，批號(hào)121112，成都錦華藥業(yè)。水合氯醛(分析純)：上海國藥集團(tuán)。NAG試劑盒：規(guī)格50T，批號(hào)20130115，購自南京建成生物工程研究所。主要儀器：電熱恒溫水浴箱(北京賽多利斯儀器有限公司)，全自動(dòng)血生化分析儀(日立HITACHI，7100)，全自動(dòng)血液分析儀(希森美康SYSMEX，XT-2000iv)，離心機(jī)：賽默飛世爾公司，型號(hào)：LEGENO MICRO 17R。5 mL 注射器、20 mL注射器、灌胃管、普通采血管、手術(shù)剪、刀片、開口器、手術(shù)鑷。

1.3方法

1.3.1藥品的配制 通城虎醇提物的制備：以6.5 kg通城虎生藥和50 L 95%乙醇濃縮得到232 g/190.5 mL提取物(每1 g提取物相當(dāng)于生藥28.02 g)，即1.22 g/mL的提取物樣品(每1 mL相當(dāng)于生藥34.12 g)。通城虎提取物溶液的配制：(1)按每只大鼠體重240 g，通城虎提取物每天劑量為260 mg/(kg·d)，高劑量的配制為：稱取12.48 g通城虎提取液，裝入研缽中，倒入10 mL吐溫80，研磨混勻，加入20 mL純水混勻，轉(zhuǎn)入量筒，加純水至400 mL。中、低劑量按此法各配制400 mL通城虎提取物溶液。10%水合氯醛溶液：5.0 g水合氯醛加入50 mL生理鹽水(NS)中，攪拌均勻，配成10%溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。大鼠使用劑量為0.3 mL/100 g。

1.3.2分組及大鼠單腎切除手術(shù) 將SD大鼠隨機(jī)分為五組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組。除空白對(duì)照組以外，對(duì)其余各組大鼠進(jìn)行右腎切除手術(shù)：大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)3 d后，按體重用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，將其置于手術(shù)臺(tái)，在大鼠右側(cè)腹部切開2 cm長的切口，暴露右側(cè)腎臟，結(jié)扎腎門，將大鼠右腎摘除，逐層分別縫合腹壁肌肉和皮膚，在手術(shù)切口處給予利福平膠囊粉末進(jìn)行殺菌處理。大鼠清醒后將其放回鼠籠，自由進(jìn)食和飲水。每天對(duì)大鼠的活動(dòng)狀態(tài)和進(jìn)食量進(jìn)行觀察記錄。

1.3.3給藥方法 術(shù)后術(shù)后第5天開始灌胃給藥，給藥前各組大鼠稱量體重，高、中、低劑量組的給藥劑量分別為通城虎醇提物260、130、65 mg/(kg·d)(相當(dāng)于通城虎推薦的最高日用量的8倍、4倍和2倍)，空白組對(duì)照組和模型對(duì)照組給予相同體積的蒸餾水，1次/d，連續(xù)給藥14 d。在給藥期間觀察動(dòng)物的毛發(fā)、活動(dòng)、精神、糞便、分泌物等情況，試驗(yàn)前后稱量大鼠體重，并隨體重變化調(diào)整給藥量。

1.4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)定 于末次給藥前1 d分別將每只大鼠放入代謝籠中，禁食不禁水，收集24 h尿液，離心取上清液，測(cè)定尿量，測(cè)定尿NAG酶。末次給藥2 h后將大鼠麻醉，取材前禁食禁水，無菌環(huán)境下，將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血。取部分全血檢測(cè)紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)。其他全血經(jīng)分離血清后用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)含量。處死大鼠并進(jìn)行系統(tǒng)解剖，肉眼觀察主要臟器組織有無異常的病理改變，胸、腹腔等體腔有無異常積液。稱量心、肝、脾、肺、腎、等器官的濕重，按體重折算臟器系數(shù)(臟器重g/100 g體重)。將肝臟、腎臟組織固定，做HE 染色處理后進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。.

2 結(jié) 果

2.1大鼠的一般情況 空白對(duì)照組大鼠正常攝食、飲水，生長良好，活動(dòng)良好，無死亡情況。模型對(duì)照組大鼠造模后第5天，可見毛色恢復(fù)光澤，進(jìn)食量歲偶有減少，但精神狀態(tài)良好，活動(dòng)正常。給藥組得大鼠在給藥第3天后開始出現(xiàn)毛發(fā)凌亂，顏色發(fā)黃干枯，食欲差等反應(yīng)，高劑量組尤為明顯；給藥7 d后，可見給藥組的部分大鼠活動(dòng)減少，精神狀態(tài)不佳，高劑量組的個(gè)別雌性大鼠出現(xiàn)明顯消瘦。給藥14 d后，高劑量組大鼠的2只大鼠死亡。

2.2大鼠的體重變化 與空白對(duì)照組和模型對(duì)照組比較，大鼠在右腎切除的條件下，給予通城虎醇提物后，低劑量組在給藥5 d后體重增長速度均明顯減慢，而高劑量組和中劑量組大鼠體重可見減輕趨勢(shì)；14 d后給藥組大鼠體重均比對(duì)照組減輕(P<0.05)。模型對(duì)照組與空白對(duì)照組對(duì)比無明顯差異(P>0.05)。結(jié)果表明，通城虎醇提物可減輕右腎切除大鼠的體重。結(jié)果見圖1。

圖1 大鼠的體重變化曲線

2.3大鼠臟器系數(shù)的測(cè)定 不考慮體重變化前提下，與空白對(duì)照組比較，給藥組大鼠被連續(xù)灌胃給藥14 d，大鼠的腎臟臟器系數(shù)明顯增加(P<0.01)；高劑量組與模型對(duì)照組比較，腎臟臟器系數(shù)明顯增加(P<0.01)；各給藥組大鼠的心、肝、脾、肺臟器系數(shù)與空白對(duì)照組比較無明顯差異(P>0.05)。模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，腎臟臟器系數(shù)也增大(P<0.01)。結(jié)果見表1。但是在本實(shí)驗(yàn)中，由于給藥各組大鼠的體重是減輕的，因此給藥組大鼠臟器系數(shù)增大在對(duì)照組和藥物試驗(yàn)組之間出現(xiàn)的顯著性差異的原因有可能是給藥組動(dòng)物體重明顯下降所造成的，不能作為評(píng)價(jià)證據(jù)。

表1 通城虎提取物對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響

注：與空白組大鼠相比較，**P<0.01。與模型對(duì)照組比較，ΔΔP<0.01。

2.4大鼠尿液指標(biāo)的測(cè)定 與空白對(duì)照組比較，給藥組大鼠的尿液指標(biāo)NAG酶均高于空白對(duì)照組(P<0.05)，且隨劑量的升高呈上升趨勢(shì)。模型對(duì)照組NAG酶也略有升高，但與空白對(duì)照組比較無明顯差異。各組大鼠尿量無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 通城虎提取物灌胃給藥對(duì)大鼠尿量及尿NAG酶的影響

注：與空白組大鼠相比較，*P<0.05。

2.5大鼠腎功能血清生化指標(biāo)的測(cè)定 與空白對(duì)照組比較，高劑量組大鼠血液中的BUN 、CREA 、UA指標(biāo)均有明顯升高(P<0.01)；中劑量組CREA、UA指標(biāo)明顯升高(P<0.05)，BUN差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；低劑量組CREA明顯升高(P<0.05)，BUN、UA略有升高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較無明顯差異。見表3。

表3 通城虎提取物灌胃給藥對(duì)大鼠腎功能指標(biāo)的影響

注：與空白組大鼠相比較，*P<0.05，**P<0.01;中、低劑量組與高劑量組比較：ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

2.6通城虎提取物對(duì)大鼠肝臟組織的影響 給藥14 d后，對(duì)照組與給藥組各組大鼠肝臟組織的肝索、肝竇、匯管區(qū)、肝小葉等結(jié)構(gòu)均正常。見圖2。

注：A.空白對(duì)照組；B.高劑量組；C.中劑量組；D.低劑量組。

圖2肝臟組織變化(HE，20×)

2.7通城虎提取物對(duì)大鼠腎臟組織的影響 給藥14 d后，高劑量組大鼠中出現(xiàn)小管水變性，部分區(qū)域片狀小管溶解性壞死，殘留小管有管型形成，但炎癥反應(yīng)并不明顯，小球及血管未見明顯病變?？梢姼邉┝拷M的腎毒性已經(jīng)形成，而中、低劑量組腎臟出現(xiàn)了不同程度的腎小管水變性，中劑量出現(xiàn)管形。見圖3。

注：A.空白對(duì)照組；B.高劑量組；C.中劑量組；D.低劑量組。

圖3腎臟組織變化(HE，20×)

3 討 論

隨著中藥及中藥制劑使用范圍的擴(kuò)大，中藥相關(guān)的不良反應(yīng)報(bào)道也日益增加，其中以“馬兜鈴酸(AA)腎病”最為引人注目[4-5]。馬兜鈴酸腎病(AAN)，又稱關(guān)木通中毒性腎病，特指服用含馬兜鈴酸成分的中藥如關(guān)木通、馬兜鈴、廣防己、細(xì)辛、天仙藤、青木香等而導(dǎo)致的急性或慢性腎小管間質(zhì)疾病[6]。AA的發(fā)病機(jī)制推測(cè)如下：(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制；(2)氧化應(yīng)激機(jī)制；(3)損傷物質(zhì)聚積[7-8]。過量攝入馬兜鈴酸是導(dǎo)致AA的主要原因。通城虎來源于馬兜鈴科馬兜鈴屬植物通城虎，含有馬兜鈴酸類化合物、木脂素、生物堿和有機(jī)酸等成分[9-11]，其中含馬兜鈴酸A，7-羥基馬兜鈴酸A 及木蘭花堿馬兜鈴總酸性成分含量為0.60%，這些成分均可引起AAN，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)進(jìn)行性腎間質(zhì)纖維化，甚至可致癌致突變[12]，

本研究發(fā)現(xiàn)，給藥8 d后，與空白組比較，發(fā)現(xiàn)各給藥組大鼠的體重增長明顯減慢(P<0.05)，其中高劑量給藥組對(duì)體重影響較大，導(dǎo)致該組大鼠給藥前后體重明顯減輕(P<0.05)，空白組與模型組對(duì)比無明顯差異。NAG是溶酶體酶之一，在腎臟近曲腎小管中含量最豐富，而溶酶體是各種攻擊因子(如自由基、生物毒素、化學(xué)毒素等)容易侵犯的靶位，當(dāng)近曲腎小管損傷時(shí)會(huì)迅速誘導(dǎo)溶酶體酶釋放，尿中NAG酶顯著增高，且較其他尿酶增高更早，因此尿NAG酶是反應(yīng)腎小管損傷的敏感指標(biāo)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，通城虎給藥14 d后，高、中劑量組NAG酶明顯升高(P<0.05)，低劑量組有一定升高但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明大鼠腎臟受損，高劑量通城虎給藥具有腎臟毒性。通城虎給藥14 d，對(duì)尿量的影響，并未出現(xiàn)急性馬兜鈴酸腎病如少尿或非少尿性急性腎功能衰竭表現(xiàn)，推測(cè)是因?yàn)橥ǔ腔⒌慕o藥劑量較小，而導(dǎo)致急性馬兜鈴酸腎病的主要原因是短期內(nèi)大量服用含馬兜鈴酸的中草藥。進(jìn)一步對(duì)大鼠的肝臟和腎臟組織病理學(xué)改變進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)通城虎對(duì)大鼠的肝臟無明顯影響，而一定劑量的通城虎提取物給藥后可造成大鼠腎臟不同程度的損傷。綜上結(jié)果，通城虎提取物連續(xù)給藥14 d，即可造成大鼠明顯的腎功能損害，表現(xiàn)為：體重降低，尿肌酐、血肌酐、血尿素氮、尿NAG酶升高，腎臟組織病理學(xué)改變。

在本試驗(yàn)中大鼠的給藥計(jì)量分別為260、130、65 mg/(kg·d)，分別相當(dāng)于生藥7.29 g/(kg·d)、3.64 g/(kg·d)、1.82 g/(kg·d)。按生藥藥理試驗(yàn)動(dòng)物與人體之間的等效劑量換算[14]，大鼠換算為成人的劑量是1∶0.162，即：按成人體重為60 kg，高劑量1 d用量為70.9 g。而通城虎推薦的最高日用量為9 g[3]，因此，高劑量差不多是推薦劑量的8倍，中劑量和低劑量則分別是4倍、2倍。但低劑量仍出現(xiàn)NAG酶及血清CREA升高的腎損傷指標(biāo)。而且由于不同地域的通城虎毒性成分含量可能不同，因此在臨床使用時(shí)一定要防止藥物過量，做到個(gè)體化給藥，若是存在腎臟疾病或腎功能障礙，則應(yīng)該禁止使用；在用藥過程中密切關(guān)注毒性反應(yīng)，有條件的應(yīng)該監(jiān)測(cè)腎小管功能。