向云亞 徐晶晶

(廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建 廈門 361023)

6-姜酚(6-gingerol)是姜科姜屬植物姜Zingiber officinale Rosc的主要活性成分，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，姜酚具有強(qiáng)心、舒縮血管、抗血小板聚集、抗氧化、抗腫瘤、抑制病原微生物、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用，應(yīng)用前景廣泛。血清白蛋白是人和動(dòng)物血清中含量最豐富的一種蛋白質(zhì)，各種藥物進(jìn)入人體首先與血清白蛋白結(jié)合，通過(guò)血漿的存儲(chǔ)和運(yùn)輸，到達(dá)受體部位產(chǎn)生藥理作用。研究蛋白質(zhì)與藥物分子間的相互作用對(duì)了解藥物的作用機(jī)制具有非常重要的意義[3-4]。目前有關(guān)6-姜酚與血清蛋白相互作用的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此。本實(shí)驗(yàn)采用熒光光譜法研究了6-姜酚與牛血清蛋白(BSA)的相互作用機(jī)理，為后續(xù)6-姜酚在臨床上的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料與試藥 6-姜酚(98.55%，express technology co.Ltd，批號(hào)：MUST-11030401)：稱取6-姜酚配制成1 mmol·L-1儲(chǔ)備液；牛血清白蛋白(BSA)(廣州齊云生物技術(shù)有限公司，批號(hào)KY201001)：稱取BSA配制成10 μmol·L-1儲(chǔ)備液；Tris-HCL緩沖液(pH=7.4)，實(shí)驗(yàn)用水為二次重蒸餾水，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器 F-2500型熒光分光光度計(jì)(日本HITACHI)；CARY-50 型紫外—可見分光光度計(jì)(美國(guó)VARIAN)；BP211D型電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；DKB-501A型超級(jí)恒溫水槽(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；PHB-3型PH計(jì)(上海三信儀表廠)

1.3方法

1.3.1光譜掃描 取10 mL的具塞試管，各加入2 mL BSA儲(chǔ)備液，分別加入0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μL 6-姜酚儲(chǔ)備液，用pH 7.4 Tris緩沖溶液稀釋至5mL，將溫度分別調(diào)至300 K、310 K，以280 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，狹縫寬度為5 nm，在300～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行熒光光譜掃描，記錄6-姜酚對(duì)BSA的熒光猝滅光譜圖，同時(shí)記錄Δλ=60 nm和Δλ=15 nm的同步熒光光譜。

1.3.2熒光猝滅的機(jī)制及猝滅常數(shù)的測(cè)定 熒光猝滅過(guò)程可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑分子與熒光分子的激發(fā)態(tài)分子之間的相互碰撞而導(dǎo)致的熒光猝滅。其動(dòng)態(tài)過(guò)程遵從Stem-Volmer方程[5]：

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

式中：F0和F分別為未加入和加入6-姜酚時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度，Kq為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)，Ksv稱為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，τ0為沒(méi)有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命(約為10-8s)，[Q]為猝滅劑6-姜酚的濃度。

靜態(tài)猝滅是猝滅劑分子與熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時(shí)生成不發(fā)熒光的復(fù)合物，從而導(dǎo)致熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。靜態(tài)猝滅過(guò)程符合Lineweaver-Bruk 雙倒數(shù)方程：

(2)

式中：KLB為猝滅劑與熒光物質(zhì)的結(jié)合常數(shù)。

用靜態(tài)猝滅雙對(duì)數(shù)公式求有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)。

lg [(F0— F)/F]=lgKa+nlg[Q]

(3)

式中：n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，Ka為結(jié)合常數(shù)。

1.3.3作用力類型的確定 有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子之間的結(jié)合力主要有的氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力等。Masaki otagiri[6]總結(jié)出判斷生物大分子與小分子結(jié)合性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律，即△S>0為疏水和靜電作用力；△S<0為氫鍵和范德華力；△H>0和△S>0為典型的疏水作用力；△H<0和△S<0為氫鍵和范德華力；△H<0和△S>0為靜電作用力。通過(guò)改變反應(yīng)作用溫度計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)焓變(△H)和熵變(△S)的相對(duì)大小，可判斷小分子與蛋白質(zhì)間的主要作用力類型。計(jì)算公式如下：

ln(K2/K1)=(1/T1-1/T2)△H/R

(4)

△G =-RTlnK

(5)

△G= △H-T△S

(6)

式中：△G為吉布斯自由能變，△H為焓變，△S為熵變，K1、K2為不同溫度T1、T2下的結(jié)合常數(shù)，R為氣體常數(shù)約等于8.314。

1.3.4同步熒光光譜測(cè)定 固定BSA的0.4×105mol·L-1，改變6-姜酚濃度測(cè)定Δλ=60 nm和Δλ=15 nm的同步熒光光譜。

2 結(jié) 果

2.16-姜酚對(duì)BSA的熒光猝滅光譜的影響 當(dāng)固定BSA的量，不斷增加6-姜酚的濃度時(shí)，343 nm處 BSA的最大熒光發(fā)射峰逐漸降低。說(shuō)明6-姜酚能引起B(yǎng)SA內(nèi)在熒光有規(guī)律的淬滅，但并未出現(xiàn)明顯的發(fā)射波長(zhǎng)紅移、藍(lán)移或峰形改變。結(jié)果見圖1。

2.26-姜酚對(duì)BSA的熒光猝滅機(jī)制 按照實(shí)驗(yàn)方法分別測(cè)定300 K和310 K時(shí)體系的熒光淬滅光譜，根據(jù)式(1)以F0/F對(duì)[Q]作線性擬合(圖2)，據(jù)式(2)作雙倒數(shù)曲線，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)r，進(jìn)而計(jì)算出不同溫度下的Ksv和KLB，見表1。根據(jù)Ksv隨溫度的變化可以對(duì)猝滅機(jī)制進(jìn)行判斷。對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，溫度升高有利于猝滅過(guò)程進(jìn)行，Ksv隨溫度的升高而增大；而靜態(tài)猝滅，溫度升高形成的復(fù)合物穩(wěn)定性降低，Ksv減小。由圖2和表1中的數(shù)據(jù)可看出，Ksv中隨溫度升高而降低，KLB也隨溫度的升高而減小，同時(shí)Kq值遠(yuǎn)大于各類淬滅劑對(duì)生物大分子的最大Kq值(2×1010L·mol-1·s-1)，因此可以說(shuō)明6-姜酚對(duì)BSA的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅[7]。

圖2 6-姜酚對(duì)BSA熒光淬滅Stern-Volmer方程擬合圖

T/KStern-VolmerKq/(L/mol·s)kSV/(L/mol)rLineweaver-BurkKLB/(L/mol)r3001.453×10121.453×1040.981 91.127×1040.966 03101.078×10121.078×1040.972 11.090×1040.997 0

2.36-姜酚與BSA的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù) 以lg [(F0— F)/F]對(duì)lg[Q]作圖(圖3)，根據(jù)截距和斜率求得 6-姜酚與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)，見表2。由表2可知，6-姜酚與BSA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)接近1，說(shuō)明6-姜酚與BSA可形成1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合常數(shù)較大，且隨著溫度的升高而降低，表明6-姜酚與BSA之間有較強(qiáng)的結(jié)合作用，可以被蛋白質(zhì)運(yùn)輸和儲(chǔ)存。

圖3 6-姜酚與BSA的雙對(duì)數(shù)方程圖

T/KKa/(L/mol)rn3002.173×1050.97911.2633101.799×1040.98811.059

2.46-姜酚與BSA的作用力類型 根據(jù)熱力學(xué)關(guān)系式(4)(5)(6)，計(jì)算6-姜酚與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，見表3?！鱃<0，△H<0，△S<0，表明6-姜酚與BSA之間的作用力主要為氫鍵和范德華力。

表3 6-姜酚與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

2.56-姜酚對(duì)BSA同步熒光光譜的影響 Δλ=15 nm和Δλ=60 nm所得同步熒光光譜分別顯示酪氨酸殘基和色氨酸殘基的特征熒光[8]。而蛋白質(zhì)中色氨酸、酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)與其所處微環(huán)境極性有關(guān)，因此，根據(jù)最大發(fā)射波長(zhǎng)的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移，表明氨基酸殘基所處的微環(huán)境的疏水性降低，極性增強(qiáng)；藍(lán)移則反之。固定BSA的濃度，逐漸增加6-姜酚濃度，分別測(cè)定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步熒光光譜，結(jié)果如圖4所示。隨著6-姜酚濃度的增加，和色氨酸殘基的特征熒光光譜峰均隨著6-姜酚濃度的增加而產(chǎn)生淬滅，酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了一定程度的藍(lán)移；而色氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)基本不變，說(shuō)明6-姜酚的加入主要改變了BSA酪氨酸殘基附近的微環(huán)境，使酪氨酸殘基所處的微環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，極性降低。

3 討 論

血清白蛋白是血漿蛋白的主要成分，以血清白蛋白為代表的蛋白質(zhì)與中草藥有效成分間的相互作用，已成為一個(gè)非常活躍的研究課題[9]，這將有助于了解藥物在體內(nèi)的存在狀態(tài)、運(yùn)輸、吸收、代謝及作用機(jī)制。目前，結(jié)構(gòu)最為明確、運(yùn)用得最多的是牛血清白蛋白以及人血清白蛋白[10]。而熒光光譜法是獲得這類相互作用信息的一種方便、快捷方法。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用熒光技術(shù)研究在模擬人體生理pH條件下6-姜酚與牛血清白蛋白的相互作用，結(jié)果表明，6-姜酚是一個(gè)比較強(qiáng)的熒光猝滅劑，可以導(dǎo)致BSA的內(nèi)源熒光的猝滅，猝滅不是由于6-姜酚對(duì)BSA碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅，而是由于6-姜酚與BSA形成了復(fù)合物引起的靜態(tài)猝滅，且兩者相互作用以氫鍵和范德華力結(jié)合為主。表觀結(jié)合常數(shù)表明6-姜酚與BSA之間有較強(qiáng)的結(jié)合作用，可以被蛋白質(zhì)運(yùn)輸和儲(chǔ)存，通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)作用部位，起到治療的效果。同步熒光光譜實(shí)驗(yàn)提示6-姜酚可使酪氨酸殘基所處的微環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，極性降低，這種變化可能會(huì)影響一些極性藥物與血清蛋白的結(jié)合。本研究對(duì)于闡明6-姜酚在血液中的存在狀態(tài)及其體內(nèi)代謝過(guò)程具有一定的指導(dǎo)意義。