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苗藥九仙羅漢接骨湯促進SD大鼠脛骨骨折愈合中TGF-β1動態(tài)表達

2019-05-10 11:03羅清龍唐良華熊屹劉玉召
貴州醫(yī)藥 2019年4期
關(guān)鍵詞:羅漢生理鹽水造模

羅清龍 唐良華 熊屹 劉玉召

(1.四川省德昌縣人民醫(yī)院骨科,四川 德昌 615500;2.貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院骨二科,貴州 貴陽 550002;河南省開封市人民醫(yī)院骨科,河南 開封 475000)

骨折是指骨的力學完整性、連續(xù)性的丟失,繼而患者自感傷處疼痛,體查發(fā)現(xiàn)骨折處出現(xiàn)腫脹、功能障礙及局部骨擦音、異常活動等表現(xiàn)的一類疾病,常因外傷而引起,是最為常見的外科疾病之一。苗醫(yī)藥加速骨折愈合的動物實驗、病例研究報道較少。本實驗組運用現(xiàn)代基因及蛋白檢測的技術(shù),檢測苗藥九仙羅漢接骨湯對SD大鼠脛骨骨折后TGF-β1細胞因子的動態(tài)表達,以探究其加速骨折愈合的機理。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 8周齡健康SD大鼠120只,SPF級,雌雄各半,體重(220±20) g,由貴陽中醫(yī)學院動物所購買。許可編號:SCXK-(軍)2012-0011。

1.1.2實驗藥物 九仙羅漢接骨湯煎劑由仙桃草20 g、九節(jié)茶15 g、地羅漢3 g組成。九仙羅漢接骨湯的成人(70 kg)每日劑量為生藥0.54 g/kg,按人/鼠體表面積比率換算等效計量法計算后,每只每天0.68 g/mL,稀釋至0.17 g/mL。按傳統(tǒng)方法煎煮后無菌封瓶,4 ℃冷藏柜儲存?zhèn)溆谩I睇}水(均由貴陽中醫(yī)二附院提供)。

1.1.3主要試劑和儀器 SABC免疫組化試劑盒(Biomics公司);DAB顯色試劑盒及一抗、二抗、PBS緩沖液(Boisynthesis公司);EDTA脫鈣液(pH 7.2)、4%多聚甲醛、二甲苯、Goldview Ⅰ(美國Solarbio公司);TriZol總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒、5x RNA Loading Buffer(TaKaRa Bio公司);7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司);瓊脂糖凝膠電泳儀、瓊脂糖凝膠電泳槽(BIORAD公司);NanoDrop2000超微量分光光度計(德國Thermo Scientific公司)、顯微圖像分析儀(德國opten公司)。

1.2方法

1.2.1骨折模型的建立(改良鉆孔法) 大鼠采用腹內(nèi)注射法麻醉(7%水合氯醛,0.5 mL/100 g),麻醉滿意后予6%的硫化鈉左下肢脫毛備皮,清潔紗布擦拭,右側(cè)臥位放于造模臺上,自制固定模具使左小腿水平放置。碘伏棉球由左足到左大腿上段消毒3遍。無菌布巾覆蓋展露造模區(qū)四周,鉗定穩(wěn)固。于脛骨結(jié)節(jié)下2 mm沿脛骨脊切長約1.5 cm縱行切口,分撥鼠外皮,繼續(xù)沿脛骨脊外側(cè)緣0.5 mm縱軸方向切開淺、深筋膜層,分撥開脛骨前肌群,展露脛骨外骨面。充分顯露術(shù)野后,小功率鉆在鼠膝關(guān)節(jié)脛骨結(jié)節(jié)下2 m處由脛骨外骨面向髓腔造孔道1,鉆頭直徑為0.3 mm,可鉆達髓腔,但不破壞內(nèi)側(cè)骨外皮質(zhì),原孔道1處換1 mm鉆頭擴大孔道,在第一孔下沿脛骨縱軸方向,孔間距2 mm,依照前法造孔道2及孔道3。生理鹽水沖洗后,分層縫合切口處組織,適量紅霉素軟膏外敷傷口及周緣,麻醉清醒后分籠飼養(yǎng),此后持續(xù)3 d給予8萬單位青霉素肌內(nèi)注射[1]。

1.2.2分組及標本取材 所有造模成功大鼠隨機均分成接骨湯組、生理鹽水組。接骨湯組麻醉復蘇后灌予九仙羅漢接骨湯,2 mL/次,Bid,生理鹽水組灌予等量生理鹽水。常規(guī)分籠飼養(yǎng)。術(shù)后1、3、7、14、21、28 d分批拉頸處死,每組各10只,以造模處為中心取10 mm骨段。

1.2.3免疫組化技術(shù)檢測骨痂組織中TGF-β1表達 截取5 mm骨段,4%多聚甲醛淹沒標本,4 ℃冰箱下固定24 h,予PBS液清洗×3次,20 min/次。移至EDTA中脫鈣,量約10mL ,更替EDTA液1 W/次,持續(xù)30 d。不銹鋼針插入后未感受阻力,此情況提示脫鈣達標。2%NaOH浸泡,時間10 min,雙蒸水洗,時間10 min。依次經(jīng)乙醇脫水六次,放入無水乙醇與二甲苯比例1∶1液體中20 min,轉(zhuǎn)移至純二甲苯20 min。侵蠟30 min。包埋后運用切片機以骨折端中央為中心縱行切開制成5 μm厚的蠟片,40 ℃水中展片至無皺褶,放置于60 ℃烘箱40 min,烘干切片。依次經(jīng)脫蠟至水、抗原修復、染色、顯色劑顯色、復染、分化、藍化、脫水后中性樹脂封片,光鏡觀察。結(jié)果判定:蛋白水平表達與大鼠脛骨骨痂組織中出現(xiàn)褐黃色顆粒數(shù)及顏色深度呈正相關(guān)性。未顯褐黃色者為陰性。10×40倍光鏡下視檢采圖,所得骨組織片再在10×10倍光鏡下隨機抽取3個視野作陽性表達計數(shù),各標本TGF-β1表達的計量指標以3個視野計數(shù)均值為準。

1.2.4q-PCR檢測骨痂細胞中TGFβ1mRNA表達量 研磨缽在180℃環(huán)境烤干1.5~2h,將從-80℃冰箱中取出已備好的骨痂組織用骨鉗夾碎后放入研磨缽中,棒研磨標本加入覆蓋骨痂組織的液氮后使用研磨成細粉,提取骨痂組織中的總RNA。所選基因引物序列由上海凱信生物科技有限公司設(shè)計合成。TGF-β1擴增片斷長度為111 bps,其上游引物序列為:5’TCAATACGTCAGA-CATTCGG3’,下游引物序列:5’TACCAAGGTAACGCCAGGA 3’。同時以擴增片段長度155 bp 的actin 作為內(nèi)參照,actin上游引物序列:5’-ACTCTGTGTGGATTGGTGGC-3’,下游引物序:5’-AGAAAGGGTGTAAAACGCAGC-3’。采用瓊脂糖凝膠電泳法測定總RNA完整性。NanoDrop2000超微量分光光度計進行總RNA濃度及OD260/280檢測,測定總RNA質(zhì)量是否達到實驗要求。在ABI 7500 PCR器上進行操作,反應(yīng)設(shè)置為:95 ℃,10 min;95 ℃,30 s;60 ℃,1 min。重復第2步,共40個循環(huán)。采用染料法(SYBR Green I)進行TGF-β1mRNA相對定量分析,用2-△△ct法分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1實驗動物分析 骨折模型的制作過程中,4只SD大鼠因麻醉不當而死亡,均予以補充。大鼠左脛骨造模術(shù)口均愈合良好,無一例感染。拉頸處死前所有大鼠均健活,且生長良好,飲食、二便、呼吸頻率、精神狀態(tài)和活動均正常,口、鼻、耳、眼均無異常分泌物,說明苗藥九仙羅漢接骨湯口服具有一定的安全性。

2.2免疫組化檢測結(jié)果分析 TGF-β1蛋白表達水平與大鼠脛骨骨痂組織中出現(xiàn)褐黃色顆粒數(shù)及顏色深度呈正相關(guān)性。與生理鹽水組相比,接骨湯組中TGF-β1的MOD值在骨重建14~28 d時差異顯著(P<0.01)。該結(jié)果提示在苗藥干預后14~28 d接骨湯組中的TGF-β1的平均光密度值的升高程度明顯高于生理鹽水組。接骨湯組骨折模型所取標本中骨祖細胞數(shù)量、成軟骨細胞數(shù)量、骨小梁出現(xiàn)的時相及重建程度均優(yōu)于生理鹽水組。見表1、圖1。

表1 不同時相中TFG-β1平均光密度值

注:與生理鹽水組比較▲P<0.01。

圖1 兩組不同時相TGF-β1的免疫組化檢測( ×400)

2.3q-PCR方法檢測結(jié)果 理想的RNA純度A260/A280應(yīng)在1.9~2.1范圍之間。經(jīng)檢測,各組總RNA的純度及濃度符合實驗要求。骨痂組織總RNA提取結(jié)果可明顯見28S、18S條形光帶的出現(xiàn),且28S條形光帶明亮度約為18S條形光帶的2倍,條帶周圍未見拖尾現(xiàn)象,說明接骨湯組和生理鹽水組中樣本提取的RNA具有良好的完整性,符合本實驗要求,見圖2。

圖2 總RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.4不同時間中TGF-β1mRNA相對表達情況 接骨湯組在造模后第1~3天TGF-β1mRNA表達量與生理鹽水組相當(P>0.05);在7 d時接骨湯組表達量是生理鹽水組的1.34倍,相較有差異(P<0.05);在14 d時接骨湯組表達量是生理鹽水組的1.45倍,在21 d時接骨湯組表達量是生理鹽水組的1.85倍,在28 d時接骨湯組表達量是生理鹽水組的2.05倍,14~28 d時相同時相比較均有顯著差異(P<0.01)。見表2。

表2 不同時間中 TGF-β1mRNA相對表達

注:與生理鹽水組比較,△P<0.05,▲P<0.01。

3 討 論

苗族醫(yī)者認為氣與血是人體的重要要素,其與人體健康密切相關(guān),因此“氣常阻,血常瘀”是人體發(fā)病的重要原因之一。本課題組從中醫(yī)“骨折三期分治”和苗醫(yī)“通氣散血法”、“毒亂致病論”相結(jié)合下的理論指導下挖掘出民間經(jīng)驗方苗藥九仙羅漢接骨湯,其具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、接骨續(xù)筋之功效。方中藥物由仙桃草、九節(jié)茶、地羅漢組成。先現(xiàn)代藥理學來看,綠原酸做為仙桃草主要成分之一,其能夠明顯的加快成骨折后骨細胞增殖分化,從而加速骨折愈合[2]。方芳等[3]對仙桃草促進骨折愈合機制進行探討,通過兔骨缺損造模仙桃草干預性治療后檢測VEGF細胞因子,發(fā)現(xiàn)單味苗藥仙桃草可在骨重建早期提高VEGF的表達,獲得加速骨重建的效應(yīng)。仙桃草內(nèi)服能促進骨不連模型兔骨折端中BMP-2、VEGF表達從而使兔橈骨骨不連得到改善[4-5]。臨床研究[6]也表明仙桃草具有幫助骨折斷端重建、修復的效果。本實驗組前期[7-9],通過苗藥九仙羅漢接骨湯干預兔脛骨干骨折動物模型,并以血Ca、血P、ALP、X線片評定骨痂生長、HE染色及VEGF免疫組化結(jié)果為指標,發(fā)現(xiàn)苗藥九仙羅漢接骨湯使骨痂成型加快,進而有減少骨折愈合時間的效果。

TGF-β家族都是由兩條相同肽鏈組成的多肽。研究[10-11]發(fā)現(xiàn),相對于TGF-β2和TGF-β3只有在軟骨形成期才能表達,TGF-β1在骨重建啟動后表達的時間最長,且在骨組織中含量較高。組織中的TGF-β1在骨折后重建過程中,具有加快成骨母細胞有絲分裂的的生物學功能,增加骨折部位成骨細胞、成骨基質(zhì)的募集,并且在整個骨重建的過程中TGF-β1都會周期性增長并參與整個骨折愈合的調(diào)節(jié),只是在不同時期TGF-β1表達情況不同。本研究結(jié)果中,接骨湯組與生理鹽水組的TGF-β1蛋白及基因的表達均呈階梯性增長,再次驗證了TGF-β1參與整個骨折愈合過程。TGF-β1是骨重建過程中軟骨內(nèi)成骨的標志性因子之一[12]。相關(guān)研究[13]發(fā)現(xiàn),通過桃紅四物湯調(diào)控外源性TGF-β1,作用于骨母細胞,從而對成骨細胞的數(shù)量及活性進行調(diào)節(jié),加快骨重建。本研究結(jié)果中,1~7 d時,接骨湯組與生理鹽水組TGF-β1平均光密度值同一時段相當。而在14~28 d時,接骨湯組14~28 d時間內(nèi)MOD值顯著高于生理鹽水組。接骨湯組在造模后第1~3 d TGF-β1mRNA表達量與生理鹽水組同一時段相當;而在7~28 d時相內(nèi),接骨湯組TGF-β1mRNA表達量分別是生理鹽水組的1.34倍、1.45倍、1.85倍、2.05倍。兩組TGF-β1基因及蛋白的表達量在骨折愈合過程中隨時相的增加而階梯性增長,但生理鹽水組表達明顯低于接骨湯組。免疫組織化學檢測中,接骨湯組骨折模型所取標本中骨祖細胞數(shù)量、成軟骨細胞數(shù)量、骨小梁出現(xiàn)的時相及重建程度均好于生理鹽水組。

綜上,通過九仙羅漢接骨湯干預后增強TGF-β1表達從而有效的縮短了模型鼠骨重建的時間。不足之處在于,此次實驗中只是根據(jù)不同時相進行分組,未探究苗藥九仙羅漢接骨湯低、中、高濃度的最佳配比,得出最佳效果;其次,苗藥九仙羅漢接骨湯的毒副作用實驗尚未完善,均擬在下一步實驗中繼續(xù)探究。

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