劉 婷， 錢冬萌， 胡 明， 于 淼， 張現(xiàn)娟， 秦子英， 劉小可， 王 斌

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，山東 青島 266071)

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)為線性雙鏈DNA病毒，屬于β皰疹病毒亞科[1]。HCMV感染相當(dāng)普遍，我國普通人群感染率為80%以上，某些特殊地區(qū)或人群中可達(dá)100%[2]。IE86基因修飾小鼠模型是利用DNA原核顯微注射方法，將IE86基因整合到小鼠其中一條染色體上，從而得到半合子首代(F0)轉(zhuǎn)基因小鼠，其后代只有一部分個(gè)體帶有整合的基因。理論上，F(xiàn)1代小鼠中有50%為轉(zhuǎn)基因雜合子小鼠，50%為野生型小鼠，需要進(jìn)行篩選鑒定。在制作同一批轉(zhuǎn)基因小鼠后，將其中的一部分與正常的野生型小鼠雜交，再通過同一窩的陽性雌雄小鼠交配，在基因同源重組作用下，最終得到純合子小鼠。IE86是一種重要的反式激活因子，在HCMV復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并與許多疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。先前的研究表明，IE86通過與細(xì)胞基因或蛋白直接相互作用來調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中的宿主基因表達(dá)并且影響細(xì)胞的增殖與凋亡[3]。研究發(fā)現(xiàn)，HCMV感染與惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤關(guān)系密切，其基因的表達(dá)隨惡性程度增高而增高[4]。但I(xiàn)E86與惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系尚不清楚。細(xì)胞蛋白p53為腫瘤抑制基因產(chǎn)物和細(xì)胞周期抑制劑[5-6]。研究表明p53蛋白可調(diào)節(jié)各種基因的轉(zhuǎn)錄，包括涉及細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)和程序性細(xì)胞死亡[7-9]。p53蛋白能活化p21蛋白，以此蛋白為中介物質(zhì)，對細(xì)胞分化和增殖有抑制作用[10]。因此推測，IE86蛋白可通過p53信號通路對惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。本研究旨在利用可以持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)IE86的基因修飾小鼠模型，克服物種的特異性，建立一個(gè)有機(jī)內(nèi)部環(huán)境，在體內(nèi)進(jìn)一步探究IE86蛋白與p53的作用關(guān)系，及其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響，目的是闡明IE86蛋白在維持病毒感染中的作用，為惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與小鼠 PF級IE86基因修飾小鼠和野生小鼠各24只，雄性，6～7周齡，質(zhì)量為17～20 g，獲取于青島大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；UL261細(xì)胞株購自賽齊華東細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清(FBS,Hyclone)；DMEM(Hyclone)，青鏈霉素混合液(Solarbio)，兔單抗p53蛋白(Proteintech)，兔單抗p21蛋白(Bioss)，兔單抗IE蛋白(Millipore)，羊抗兔二抗(Bioss)，兔抗鼠二抗(Jackson)，引物(上海生工生物有限公司，序列見表1)，Universal Genomic DNA Kit(CWBIO)，RNApure Tissue kit(CWBIO)，Super GelRed(US Everbright Inc.)；BIO RAD Real-time PCR儀(My-iQ Optics Module)，蛋白凝膠電泳系統(tǒng)(韋伯)，顯微鏡(奧林巴斯CX31)等。

表1 所用引物

1.2 方法

1.2.1 PCR鑒定基因修飾小鼠IE86表達(dá)情況 剪去2～5 mm的小鼠尾尖組織，置于1.5 mL離心管中，加入100 μL蛋白酶K于70 ℃過夜消化。提取基因組DNA,并以此DNA為模板，加入IE86引物、反應(yīng)酶等進(jìn)行PCR擴(kuò)增DNA。反應(yīng)產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的DNA條帶。

1.2.2 小鼠腋下接種細(xì)胞并觀察生長情況 傳代培養(yǎng)UL261細(xì)胞，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞懸液0.1 mL(約3×106個(gè)活細(xì)胞)，取IE86基因修飾小鼠和野生小鼠各12只，將細(xì)胞緩慢注入右腋下部皮膚。腫瘤移植后觀察腫瘤種植部位出瘤的時(shí)間、腫瘤大小、質(zhì)地等情況及變化。游標(biāo)卡尺每2 d測量腫瘤的最長徑(a)及最短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積，公式為 V(mm3)=a×b2×0.5。以腫瘤體積(縱坐標(biāo))對時(shí)間(橫坐標(biāo))的變化繪制兩組腫瘤生長曲線。終止實(shí)驗(yàn)時(shí)，測量終末瘤重量。

1.2.3 HE染色 取組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水且石蠟包埋，切片厚5 mm，常規(guī)脫蠟，蘇木素染色8 min，自來水沖洗去浮色，1%鹽酸乙醇分化5～10 s，自來水沖洗，溫水返藍(lán)2 min，伊紅1 min，自來水沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR 以β-actin作為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因以及目的基因各設(shè)3個(gè)平行反應(yīng)管。反應(yīng)體系為20 μL，其中10 μL SYBR green mixture，IE86、p53上下游引物分別為1 μL，2 μL cDNA，6 μL ddH2O。94 ℃ 3 min，94 ℃ 10 min，55 ℃ 30 s，循環(huán)40次。在55 ℃ 30 s時(shí)讀取熒光值。

1.2.5 免疫組化 取組織石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟，放入免疫組化抗原修復(fù)緩沖液(pH值6.0)煮沸冷卻至室溫，用蒸餾水和PBS洗滌10 min，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，洗滌后滴加p53(稀釋濃度1∶100)、p21(稀釋濃度1∶100)抗體并于37 ℃避光放置1 h，洗滌后滴加二抗(稀釋濃度1∶100)于37 ℃放置30 min，洗滌后加DAB顯色1 min，蘇木素染色1 min，常規(guī)脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.6 TUNEL檢測腫瘤組織中細(xì)胞凋亡情況 取組織石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟，滴加蛋白酶K，室溫5 min后PBS洗滌，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，洗滌后滴加TUNEL反應(yīng)液覆蓋組織，37 ℃避光放置1 h。洗滌后加POD轉(zhuǎn)換液，37 ℃避光放置30 min，洗滌后加DAB顯色1 min，蘇木素染色1 min，常規(guī)脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所得數(shù)據(jù)以 χ±S表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較進(jìn)行單因素方差分析，*P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因修飾小鼠IE86表達(dá)情況

從小鼠尾尖中提取DNA，PCR法鑒定IE86陽性和陰性小鼠。結(jié)果顯示，基因修飾小鼠中IE86顯著表達(dá)，野生小鼠無IE86表達(dá)，結(jié)果表明成功構(gòu)建了IE86基因修飾小鼠模型(圖1)。根據(jù)IE86是否表達(dá)將小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。

2.2 荷膠質(zhì)瘤鼠腫瘤生長情況

將UL261細(xì)胞懸液植入皮下2周后，荷瘤鼠開始出現(xiàn)倦怠少動(dòng)以及消瘦現(xiàn)象。植瘤6 d時(shí)，肉眼觀察荷瘤鼠腋下可見豆粒大小腫塊。接種17 d時(shí)，荷瘤鼠腋下腫瘤呈近指數(shù)生長，隨時(shí)間增加，腫瘤體積呈明顯增大(圖2A)。荷瘤鼠平均生存期為17～25 d，致瘤率為100%。解剖荷瘤鼠可見腫瘤呈橢圓形或不規(guī)則形，邊界較清楚，瘤體解剖面為實(shí)性，色白且呈魚肉狀，瘤內(nèi)可見出血壞死灶(圖2B)。高倍鏡下觀察，HE染色可見腫瘤組織內(nèi)瘤細(xì)胞呈圓形、橢圓形和梭形，胞核大而圓；細(xì)胞增生活躍，分裂相多見，細(xì)胞核較多(圖2C)。實(shí)驗(yàn)終末時(shí)IE86陽性腫瘤組織的瘤體積顯著高于IE86陰性組，差異有顯著意義(P<0.05) (圖2D)。終末瘤體的重量差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) (圖2E) 。

圖1 PCR鑒定基因修飾小鼠模型IE86表達(dá)情況Fig.1 PCR identification of UL122 gene modified mouse model construction

M:DNA分子標(biāo)記；1:陰性條帶；2:陽性條帶；-:水對照；+:陽性對照；PCR產(chǎn)物條帶大小為211 bp

M:DNA molecular marker;1:negative band;2:positive band;-:water control;+:positive control；The PCR product band size was 211 bp

2.3 IE86對惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中p53 mRNA表達(dá)的影響

Real-time PCR 結(jié)果顯示(圖3)，與IE86陰性腫瘤組織相比IE86陽性腫瘤組織p53表達(dá)量顯著增高，差異有顯著意義(P<0.05)；同時(shí)與IE86陰性腦組織相比IE86陽性腦組織p53表達(dá)量也顯著增高，差異有顯著意義(P<0.05)。IE86陽性腫瘤組織和IE86陽性腦組織中存在IE86基因表達(dá)，IE86陰性腫瘤組織和IE86陰性腦組織中不表達(dá)IE86基因。

2.4 IE86對惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中p53蛋白表達(dá)的影響

取組織石蠟包埋切片進(jìn)行免疫組化以檢測p53蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示(圖4)，腫瘤組織中p53陽性染色明顯強(qiáng)于正常腦組織，且與IE86陰性腫瘤組織相比IE86陽性腫瘤組織p53蛋白陽性染色明顯增強(qiáng)，差異有顯著意義(P<0.05)，與IE86陰性腦組織相比IE86陽性腦組織p53表達(dá)量也顯著增高，差異有顯著意義(P<0.05)，這與Real-time PCR 結(jié)果相一致。

圖2 IE86基因修飾小鼠腋下荷 瘤生長情況況Fig.2 Effect of IE86 protein on the growth of tumor bearing mouseA、B:小鼠荷瘤情況(a、b分別為陰性和陽性小鼠)；C:腫瘤組織病理情況(a、b分別為陰性和陽性小鼠)；D、E:荷瘤小鼠腫瘤生長情況, *P<0.05A, B: tumor-bearing condition in mice (a, b are negative and positive mice, respectively); C: pathological condition of tumor tissue (a, b are negative and positive mice, respectively); D, E: tumor growth of tumor-bearing mice Situation, *P<0.05

圖3 Real-time PCR檢測IE86與 p53的mRNA表達(dá)情況Fig.3 The expression of IE86 and p53 mRNA was detected by Real-time PCR與IE86陰性組比較, *P<0.05Compared with IE86-negative group, *P<0.05

圖4 免疫組化檢測腫瘤組織中IE86 與p53的蛋白表達(dá)情況Fig.4 Immunohistochemistry detection of IE86 and p53 protein expression in tumor tissueA:IE86陽性腫瘤組織；B:IE86陰性腫瘤組織；C:IE86陽性腦組織；D:IE86陰性腦組織； E:p53蛋白表達(dá)水平, *P<0.05A: IE86 positive tumor tissue; B: IE86 positive brain tissue;C: IE86 negative tumor tissue; D: IE86 negative brain tissue; E: p53 protein expression level, *P<0.05

2.5 IE86對惡性膠質(zhì)瘤組織中p53轉(zhuǎn)錄活性的指示標(biāo)志p21的影響

取組織石蠟包埋切片進(jìn)行免疫組化以檢測p21蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示(圖5), 腫瘤組織中p21陽性染色明顯強(qiáng)于正常腦組織，IE86陽性組和陰性組相比p21蛋白染色明顯減弱,正常腦組織中IE86陽性組和陰性組相比p21蛋白染色同樣明顯減弱(P<0.05)。這表明IE86可下調(diào)惡性膠質(zhì)瘤組織中p53轉(zhuǎn)錄活性的指示標(biāo)志p21。

2.6 IE86轉(zhuǎn)基因鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況

TUNEL陽性細(xì)胞在光鏡下細(xì)胞核棕黃色濃染，凋亡細(xì)胞多以散在分布為主。每張切片隨機(jī)取 5個(gè)高倍鏡視野用以計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù),凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比 (即凋亡指數(shù) apoptotic index AI)取平均值。結(jié)果表明(圖6)，IE86陽性腫瘤組織與IE86陰性腫瘤組織相比凋亡細(xì)胞數(shù)較少，凋亡指數(shù)較低(P<0.05)；并且與IE86陰性腦組織相比IE86陽性腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)較少，凋亡指數(shù)較低(P<0.05)。

圖5 免疫組化檢測腫瘤組織中p21 表達(dá)情況Fig.5 Detection of p21 expression in tumor tissues by ImmunohistochemistryA:IE86陽性腫瘤組織；B:IE86陰性腫瘤組織；C:IE86陽性腦組織；D:IE86陰性腦組織；E:p21蛋白表達(dá)水平, *P<0.05A: IE86 positive tumor tissue; B: IE86 positive brain tissue; C: IE86 negative tumor tissue; D: IE86 negative brain tissue; E: p21 protein expression level, *P<0.05

圖6 TUNEL檢測腫瘤組織中細(xì)胞凋亡情況Fig.6 TUNEL Detection of Apoptosis in Tumor Tissues

A:IE86陽性腫瘤組織；B:IE86陰性腫瘤組織；C:IE86陽性腦組織；D:IE86陰性腦組織；E:凋亡指數(shù), *P<0.05

A: IE86 positive tumor tissue; B: IE86 negative tumor tissue; C: IE86 positive brain tissue; D: IE86 negative brain tissue; E: apoptotic index, *P<0.05

3 討 論

HCMV感染和惡性膠質(zhì)瘤之間的關(guān)系密切，其中IE蛋白是HCMV感染后最活躍的細(xì)胞調(diào)控蛋白。有研究表明IE蛋白可反式激活多種細(xì)胞基因進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖與凋亡[11]，其中IE86是最主要的功能蛋白[12]。IE86通過調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)的重要抑癌基因 p53從而影響細(xì)胞的生長和功能，為HCMV 感染后進(jìn)行干預(yù)宿主細(xì)胞的重要環(huán)節(jié)。但目前對IE86與p53關(guān)系的研究尚無一致性的結(jié)論。

本研究采用IE86基因修飾小鼠模型，是利用DNA原核顯微注射方法，將IE86基因整合到小鼠其中一條染色體上，從而得到半合子首代(F0)轉(zhuǎn)基因小鼠。在制作同一批轉(zhuǎn)基因小鼠后，將其中的一部分與正常的野生型小鼠雜交，再利用PCR篩選鑒定IE86陽性小鼠，用以后續(xù)實(shí)驗(yàn)。p21基因隸屬于CIP/Kip家族，是位于p53基因下游的細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子，可與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)/cyclin 復(fù)合物結(jié)合并抑制其活性，這些復(fù)合物與p53介導(dǎo)的G1/S期阻滯關(guān)系密切[13]。p53基因可以誘導(dǎo)其下游基因p21的轉(zhuǎn)錄，從而增加p21蛋白的合成[14]。研究表明，p21與腫瘤的分化、浸潤、增生和轉(zhuǎn)移等有關(guān)[15]，早期研究顯示HPVl6 E5可以抑制p21基因啟動(dòng)子的活性并下調(diào)其表達(dá)水平，p21作為調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵蛋白，其下調(diào)最終導(dǎo)致細(xì)胞生長加快且呈惡性增殖[16]。然而，HCMV IE86對p53及其下游基因p21影響的研究卻少見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，HCMV IE86能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化且抑制腫瘤細(xì)胞凋亡?；蚝偷鞍讬z測結(jié)果顯示在惡性腫瘤中p53的表達(dá)與IE86的表達(dá)存在明顯正相關(guān)性。為進(jìn)一步證明IE86對p53在惡性膠質(zhì)瘤中轉(zhuǎn)錄活性的影響，利用免疫組化檢測腫瘤組織中p53下游基因p21蛋白表達(dá)情況，并用TUNEL法檢測腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，IE86可下調(diào)p53轉(zhuǎn)錄活性，提高惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞抗凋亡能力。本研究建立的IE86基因修飾小鼠模型，有利于進(jìn)一步探討HCMV IE86在惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。