張學秋， 余曉斌, 劉詠梅

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122)

蟬花是我國傳統(tǒng)名貴滋補中藥材，是藥食兼用蟲生真菌，由蟬的幼蟲感染蟬擬青霉屬真菌形成[1]，與冬蟲夏草具有相似的活性成分和功能，可作為互補藥材[2]。蟬花中含有豐富的活性物質，如多糖、核苷類、蟲草酸、氨基酸、脂肪酸、環(huán)肽類、麥角固醇等，具有滋補保健、鎮(zhèn)靜催眠、免疫調節(jié)、改善腎功能、抗腫瘤等多種藥理作用[3-5]。天然蟬花資源短缺，研究發(fā)現(xiàn)人工培養(yǎng)的蟬花與天然蟬花營養(yǎng)成分十分接近，蟬擬青霉為蟬花的無性型階段，可采用人工培養(yǎng)的方法進行工業(yè)化生產，因此可通過液體發(fā)酵蟬擬青霉來方便、快速地提取制備生物活性物質，克服天然蟬花資源不足的缺點[6]。多糖是蟬花的主要活性成分之一，具有抗腫瘤、增強免疫、抗氧化、改善腎功能等多種藥理作用[7-8]，在功能性食品開發(fā)和醫(yī)療保健方面有著非常好的應用前景。謝飛等[9]研究表明，蟬花多糖在體內外均具有明顯的抗腫瘤活性，而且能夠增強免疫調節(jié)。目前關于蟬擬青霉液體發(fā)酵產胞內多糖的研究較多，但是關于蟬擬青霉胞外多糖的研究較少，且對蟬擬青霉液體發(fā)酵的研究尚處于搖瓶培養(yǎng)階段，因此本研究對搖瓶培養(yǎng)條件下蟬擬青霉的液體發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，并采用發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)，可為蟬擬青霉液體發(fā)酵的工業(yè)化生產提供參考，從而為蟬擬青霉胞內活性物質和胞外多糖的開發(fā)及應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 蟬擬青霉菌株(Paecilomycescicadae)，本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基(質量分數(shù)，%) 斜面培養(yǎng)基：土豆20，葡萄糖2，瓊脂2，pH自然；種子培養(yǎng)基：葡萄糖4，玉米粉2，MgSO4·7H2O 0.15，KH2PO40.22，麩皮1，裝液量75 mL/250 mL搖瓶；優(yōu)化前基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4，牛肉膏0.5，MgSO4·7H2O 0.05，KH2PO40.1，麩皮0.5，裝液量75 mL/250 mL搖瓶。以上培養(yǎng)基均121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min，葡萄糖等還原糖115 ℃單獨滅菌。文中“%”均表示質量分數(shù)。

1.1.3 試劑 葡萄糖、牛肉膏、酵母膏、MgSO4·7H2O、KH2PO4、麩皮、乙醇、濃硫酸、苯酚，以上試劑均為分析純。

1.1.4 儀器與設備 高速離心機(H1850，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；紫外可見分光光度計(日立U-3900，日本日立株式會社)；生化培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；恒溫調速搖床(強樂實驗設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 挑取3～4環(huán)斜面活化的菌株于種子培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r/min培養(yǎng)3 d得種子液，將種子液按10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 d[10]。

1.2.2 分析檢測方法 ①多糖含量檢測：發(fā)酵液離心取上清，加入其3倍體積無水乙醇4 ℃靜置，離心取沉淀，加水溶解并適當稀釋后，硫酸苯酚法檢測多糖含量[11]。②生物量檢測：取一定體積發(fā)酵液，于8 000 r/min離心10 min，將菌絲體沉淀用去離子水洗滌數(shù)次后置于60 ℃干燥箱中烘干至恒重，稱重并計算生物量。③發(fā)酵液中殘?zhí)菣z測：3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS)法測殘?zhí)呛俊?/p>

1.2.3 單因素實驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基 以優(yōu)化前發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，胞外多糖含量及生物量為指標，進行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[12]。①碳源對蟬擬青霉發(fā)酵的影響：分別以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、乳糖為碳源，添加量4%，其他條件相同，篩選最佳碳源；確定最佳碳源后，添加濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%，確定最佳碳源濃度[13]。②氮源對蟬擬青霉發(fā)酵的影響：分別以牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏和蛋白胨、牛肉膏和酵母膏、酵母膏和蛋白胨為氮源，其他條件相同，添加量1%，篩選最佳氮源；確定最佳氮源后，添加濃度分別為0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%，確定最佳氮源濃度；③無機鹽對蟬擬青霉發(fā)酵的影響：添加MgSO4·7H2O的濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，確定最佳MgSO4·7H2O濃度；添加KH2PO4的濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，確定最佳KH2PO4濃度。以上實驗均做3個平行，計算均值及誤差。

1.2.4 正交實驗設計 通過單因素實驗確定了各組分的最佳濃度，但只將各組分的最佳添加量組合在一起未必可以獲得最佳發(fā)酵效果，必須將每個因素的每個水平都互相組合進行全面的實驗。針對發(fā)酵過程中蔗糖、牛肉膏、酵母膏、MgSO4·7H2O及KH2PO4對蟬擬青霉發(fā)酵的影響，選擇這幾個因素進行5因素4水平的正交實驗，具體因素和水平如表1所示。

表1 正交實驗因素及水平

1.2.5 小型發(fā)酵罐實驗 ①分批發(fā)酵時不同初糖濃度對蟬擬青霉發(fā)酵的影響：采用5 L小型發(fā)酵罐進行蟬擬青霉的擴大培養(yǎng)，在5 L發(fā)酵罐中加入3 L最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min，發(fā)酵溫度25 ℃，轉速200 r/min，接種量10%，通氣量1.0 L/min，每隔8 h取樣測定菌體生物量、多糖及殘?zhí)呛縖14]，分析不同初糖濃度4%、5%、6%、8%對發(fā)酵過程中菌體生長、碳源消耗及多糖合成的影響。②補料分批發(fā)酵對蟬擬青霉發(fā)酵的影響：在5 L發(fā)酵罐中加入3 L最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，但控制初糖濃度為3.5%，121 ℃滅菌30 min，發(fā)酵溫度25 ℃，轉速200 r/min，接種量10%，通氣量1.0 L/min，每隔8 h取樣分析發(fā)酵液中殘?zhí)呛?，當發(fā)酵液中殘?zhí)呛拷抵?.5%時開始補料，將100 mL 60%蔗糖水溶液經(jīng)121 ℃滅菌后一次性補加入罐中，使發(fā)酵液中蔗糖濃度為3.5%，發(fā)酵過程中每隔8 h取樣測定菌體生物量、多糖及殘?zhí)呛?，分析補料發(fā)酵對蟬擬青霉發(fā)酵的影響。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

2.1.1 碳源對蟬擬青霉發(fā)酵的影響 碳源篩選結果如圖1所示，以蔗糖為碳源時生物量最高達24 g/L，多糖含量最高為5.28 g/L，其次是葡萄糖，說明菌體容易利用蔗糖和葡萄糖，而蔗糖易分解且來源方便、價格低，因此以蔗糖為最佳碳源分別添加不同濃度，當蔗糖濃度為6%時多糖含量和菌體干重均最高，菌體干重為21.2 g/L，多糖含量5.2 g/L，繼續(xù)增加蔗糖濃度對菌體生長有抑制作用，過多的糖會加重菌體呼吸使發(fā)酵液中溶解氧降低，不能滿足菌體生長需求，影響代謝產物多糖的合成，因此最適碳源濃度為6%。

圖1 不同碳源及碳源濃度對胞外多糖含量和生物量的影響Fig.1 Effects of different carbon source and carbon source concentration on exopolysaccharides production and biomass

2.1.2 氮源對蟬擬青霉發(fā)酵的影響 選擇3種氮源牛肉膏、蛋白胨、酵母膏，分別單獨添加及相互組合，結果如圖2所示，采用牛肉膏和酵母膏(質量比1∶1)復合氮源時，菌體干重最高達25.4 g/L，多糖含量也最高為5.35 g/L，說明復合氮源比單一氮源效果好，復合氮源可以提供菌體更多不同的生長因子，有利于菌體生長。以牛肉膏和酵母膏(質量比1∶1)作為氮源，添加不同濃度發(fā)現(xiàn)氮源最適濃度為0.5%，此時菌體生物量達到最高為23.2 g/L，多糖含量最高為5.19 g/L，而氮源濃度過高會使發(fā)酵后期氮素積累，抑制菌體代謝及多糖合成。

圖2 不同氮源及氮源濃度對胞外多糖含量和生物量的影響Fig.2 Effects of different nitrogen source and nitrogen source concentration on exopolysaccharides production and biomass

2.1.3 無機鹽對蟬擬青霉發(fā)酵的影響 本研究考察了無機鹽KH2PO4和MgSO4·7H2O的濃度對胞外多糖含量和生物量的影響，如圖3所示，MgSO4·7H2O的濃度為0.4%時，菌體生物量達到最大為28.4 g/L；濃度0.1%時多糖含量最高為5.41 g/L，當KH2PO4的濃度為0.2%時，菌體生物量最高達29.6 g/L，而多糖含量最高是在其濃度為0.1%時。

圖3 無機鹽濃度對胞外多糖含量和生物量的影響Fig.3 Effects of different concentration of inorganic salt on exopolysaccharides production and biomass

2.2 正交實驗結果

正交實驗結果如表2所示，五因素列的極差分別是3.161、0.302、0.725、0.882、1.1，即A﹥E﹥D﹥C﹥B，因素A蔗糖的極差最大說明蔗糖水平對發(fā)酵的影響最大，它的第4水平對應多糖產量最高。由表2可知，正交試驗的最優(yōu)方案為A4B4C1D4E3，但是16次試驗中并沒有分析出來最優(yōu)方案，而與最優(yōu)方案最接近的是16號試驗，按照最優(yōu)方案補充試驗，結果測得多糖含量5.96 g/L，生物量42 g/L，效果優(yōu)于16號試驗，因此確定方案A4B4C1D4E3為最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，即蔗糖8%，牛肉膏0.75%，酵母膏0.125%，MgSO4·7H2O 0.3%，KH2PO40.2%。

2.3 小型發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)

2.3.1 蟬擬青霉菌體的生長曲線 采用5 L小型發(fā)酵罐進行蟬擬青霉的擴大培養(yǎng)，菌體的生長曲線如圖4所示，發(fā)酵初期菌體活力旺盛，延滯期較短，很快進入快速生長階段，此時碳源主要用于菌體生長，代謝產物積累較少；發(fā)酵約40 h后菌體仍處于快速生長期，此時多糖積累速度加快，碳源同時用于菌體生長及胞外多糖合成，消耗速度加快；發(fā)酵72 h后菌體到達穩(wěn)定期，多糖積累速度變緩至趨于穩(wěn)定，碳源消耗緩慢。結果表明蟬擬青霉菌體活力旺盛，生長速度較快且胞外多糖的合成是和菌體生長相偶聯(lián)的。

表2 正交實驗結果與分析

圖4 蟬擬青霉的生長曲線Fig.4 The growth curve ofPaecilomyces cicadae

2.3.2 不同初糖濃度對菌體干重的影響 考察不同初糖濃度4%、5%、6%、8%對菌體干重的影響，結果如圖5所示，初糖濃度為4%時，菌體生長速度最快，生物量增加也最快，進入穩(wěn)定期時間較早，說明在較低初糖濃度下利于菌體生長；初糖濃度為5%時，菌體生長速度也較快，生物量最高達38 g/L；初糖濃度為6%時，菌體生長速度相對較慢，進入穩(wěn)定期時間延長，最終生物量較低；初糖濃度8%時，菌體生長速度最慢，說明高初糖濃度對菌體生長有一定抑制作用。

2.3.3 不同初糖濃度對胞外多糖含量的影響 考察不同初糖濃度4%、5%、6%、8%對多糖含量的影響，結果如圖6所示，初糖濃度為4%時，多糖積累速度最快但含量不是最高，說明碳源不足不能同時滿足菌體生長和多糖合成的需要，菌體較早終止生長代謝進入穩(wěn)定期；初糖濃度為5%時，菌體生物量最高，多糖含量也最高為5.5 g/L，說明菌體量多其多糖代謝也旺盛；初糖濃度為6%時，由于較高初糖濃度對菌體生長有抑制作用，且產生一定底物抑制效應不利于多糖積累，因此發(fā)酵結束時多糖含量相對較低；初糖濃度8%時多糖積累速度最慢且含量最低，進一步說明高初糖濃度抑制多糖合成。

圖6 不同初糖濃度對胞外多糖含量的影響Fig.6 The effect of different initial sugar concentration on the production of extracellular polysaccharides

2.3.4 不同初糖濃度對殘?zhí)亲兓挠绊?不同初糖濃度的殘?zhí)亲兓鐖D7所示，初糖濃度為4%時，較低初糖濃度有利于菌體生長代謝，耗糖速度較快，發(fā)酵結束后殘?zhí)橇孔钌?；初糖濃度?%時，菌體生長及多糖合成都較旺盛，對碳源消耗較大，發(fā)酵結束時殘?zhí)橇枯^少；初糖濃度為6%時，較高初糖濃度對菌體生長有抑制作用，發(fā)酵初期降糖速度緩慢，之后隨菌體生長及代謝速度加快耗糖速度也開始加快，但較高糖濃度會產生一定底物抑制效應影響多糖代謝，菌體對蔗糖利用率較低使發(fā)酵結束時殘?zhí)橇肯鄬^高；初糖濃度為8%時，底物抑制效應愈顯著，殘?zhí)橇吭礁摺?/p>

圖7 不同初糖濃度對殘?zhí)亲兓挠绊慒ig.7 The effect of different initial sugar concentration on the change of residual sugar concentration

2.3.5 補料分批發(fā)酵 在分批發(fā)酵過程中，發(fā)酵初始糖濃度過高會抑制菌體生長代謝，而初始糖濃度過低又不能同時滿足菌體生長及代謝的需要，因此嘗試補料分批發(fā)酵，結果如圖8所示。發(fā)酵初期在較低初糖濃度下菌體生長速度較快，當發(fā)酵約32 h殘?zhí)墙档?.5%以下時開始補料，補料后菌體生長速度明顯增加，胞外多糖合成速度也開始加快，菌體進入穩(wěn)定期的時間較早。發(fā)酵結束時菌體量高達40 g/L，多糖含量最高達到5.89 g/L，均高于分批發(fā)酵。因此采用補料分批發(fā)酵有助于提高發(fā)酵水平，充分利用碳源以避免原料浪費。

圖8 補料分批培養(yǎng)時的發(fā)酵過程曲線Fig.8 The fermentation process curve of fed-batch cultivation

3 討 論

由于目前關于蟬擬青霉胞外多糖的研究較少，本研究通過單因素及正交實驗對蟬擬青霉發(fā)酵產胞外多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，確定了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基并發(fā)現(xiàn)蔗糖是影響發(fā)酵的最主要因素，該條件下獲得了較高的多糖含量及生物量，較優(yōu)化前提高了一倍，可為蟬花真菌發(fā)酵產胞外多糖的研究提供參考。

目前對蟬擬青霉液體發(fā)酵的研究尚處于搖瓶培養(yǎng)階段，因此本研究采用5 L發(fā)酵罐進行蟬擬青霉的擴大培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵罐培養(yǎng)時最適初糖濃度為5%，8%初糖濃度會產生抑制作用，這與搖瓶發(fā)酵有所不同。可能原因：一是由于發(fā)酵罐培養(yǎng)較搖瓶培養(yǎng)通風溶氧好，菌體延滯期縮短、生長更快且合成多糖時間相對較早，對碳源消耗快，但初糖濃度過高導致發(fā)酵液中滲透壓過高，影響菌體對營養(yǎng)物質的吸收利用，從而抑制菌體生長，菌體量少其代謝產生多糖也少，而搖瓶培養(yǎng)時由于菌體延滯期較長生長速度慢，對碳源消耗較慢，所以抑制作用相對不明顯；二是發(fā)酵罐培養(yǎng)時菌體合成多糖時間相對較早，存在一定產物抑制效應，且初糖濃度過高還會產生底物抑制效應，而搖瓶培養(yǎng)時多糖合成較晚且對碳源消耗慢，因此產物及底物的抑制效應相對不明顯。通過在發(fā)酵過程中補料發(fā)現(xiàn)，補料分批的發(fā)酵效果優(yōu)于分批發(fā)酵，不僅提高了多糖產量還避免了原料浪費。本研究對蟬擬青霉液體發(fā)酵產胞外多糖發(fā)酵工藝的優(yōu)化，大幅提高了胞外多糖產量及生物量，降低了生產成本，可為蟬擬青霉液體發(fā)酵的工業(yè)化應用提供參考，從而為蟬擬青霉胞內活性物質和胞外多糖的開發(fā)及應用奠定基礎。