馬麥艷， 焦子偉， 馬正海， 張相鋒*

(1.伊犁師范學(xué)院 生物與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 伊寧 835000；2.新疆大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(L.) Link)又叫北蟲草或北冬蟲夏草，屬于子囊菌亞門，核菌綱，麥角菌目，麥角菌科，蟲草屬[1]。大量理化分析證實(shí)，蛹蟲草與冬蟲夏草的活性成分和藥理作用基本相同，某些活性成分含量甚至高于冬蟲夏草，其在提高免疫能力、抗氧化性和抗腫瘤等活性方面日益得到人們認(rèn)可[2]。蛹蟲草所富含的腺苷、蟲草素、麥角甾醇及蟲草多糖等多種生物活性物質(zhì)，具有抗癌、促進(jìn)細(xì)胞分化、滋補(bǔ)益腎、抑制蛋白激酶活性等多種功能[3-5]。硒被科學(xué)家們譽(yù)為“生命的火種”“抗癌之王”[6]。人體內(nèi)缺乏硒會(huì)導(dǎo)致多種疾病[7-8]。我國(guó)處于全球的缺硒帶，全國(guó)近72%的地區(qū)不同程度地缺硒[6]。這些地區(qū)的人從食物中攝取的硒，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足機(jī)體對(duì)硒的需求。因此，開發(fā)補(bǔ)硒產(chǎn)品顯得尤為重要。蛹蟲草通過細(xì)胞代謝將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為無毒的有機(jī)硒，有利于人體更好地吸收，可作為富硒載體。近年來，我國(guó)許多學(xué)者[9-12]對(duì)于蛹蟲草生物富硒方面進(jìn)行了大量的研究。陳宏偉等[13]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)硒濃度較低時(shí)可促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)，較高濃度硒則對(duì)菌絲生長(zhǎng)有抑制作用；于田田等[14]研究了蛹蟲草液體發(fā)酵富硒過程中最佳的營(yíng)養(yǎng)條件，確定蛹蟲草富硒的最佳培養(yǎng)基配方；王權(quán)等[15]采用正交試驗(yàn)優(yōu)化磁化水培養(yǎng)富硒蛹蟲草的條件；邵穎等[16]對(duì)富硒蛹蟲草活性成分及抗氧化作用進(jìn)行了分析，結(jié)果表明富硒蛹蟲草中蟲草素、腺苷、多糖等的含量要明顯高于普通蛹蟲草；張曦文等[17]在培養(yǎng)基中添加不同濃度的Na2SeO3液體培養(yǎng)蛹蟲草,探究富硒對(duì)蛹蟲草菌絲干重及胞內(nèi)酶活性的影響，結(jié)果表明適宜的硒添加量能在不同程度上提高胞內(nèi)酶活性,但促進(jìn)效果存在差異；凌宏通等[18]研究表明，加硒可提高蛹蟲草的耐硒能力，但加入過量硒源會(huì)導(dǎo)致蛹蟲草分化時(shí)間延長(zhǎng)、子座產(chǎn)量降低。趙建英等[19]進(jìn)行富硒蛹蟲草的篩選及其耐硒特征的研究，結(jié)果表明當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為72 h左右時(shí),其生物量最大且此時(shí)的富硒效果最好。本研究在總結(jié)前人研究經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以Na2SeO4為硒源、新疆本地蛹蟲草為富硒載體，初步探討不同濃度Na2SeO4對(duì)蛹蟲草菌絲發(fā)育及子實(shí)體生長(zhǎng)情況的影響，為富硒產(chǎn)品開發(fā)尋找新的硒源開辟新思路，為新疆地區(qū)進(jìn)一步大規(guī)模栽培富硒蛹蟲草提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為MAT1-1和MAT1-2兩種不同交配型的代表菌株d9、a11，來自本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基 改良馬鈴薯(PDA)固體培養(yǎng)基；含硒培養(yǎng)液：將配好的改良PDA培養(yǎng)基[20]中分別加入一定量的Na2SeO4，配成含硒質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100、150、200 mg/L的含硒改良培養(yǎng)液；大米培養(yǎng)基：每個(gè)組培瓶加入20 g大米和20 mL不同濃度的含硒改良培養(yǎng)液，蓋緊白色透氣蓋，于115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共設(shè)計(jì)8個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)處理6次重復(fù)(見表1)。

表1 不同處理人工栽培培養(yǎng)基

1.2.2 蛹蟲草子實(shí)體人工栽培 參考努爾買買提等[21]方法進(jìn)行人工栽培。將MAT1-1、MAT1-2兩個(gè)不同交配型菌株接種于改良PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15～20 d。將活化后的兩株菌株分別接種在改良馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，獲得d9、a11兩種菌懸液，將這兩種菌懸液等體積混合均勻后用無菌水稀釋10倍，然后吸取10 mL均勻添加到各個(gè)處理的培養(yǎng)瓶中。將接種好的培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)55～60 d。培養(yǎng)期間需要人工定期對(duì)培養(yǎng)室進(jìn)行消毒擦洗，且要保持培養(yǎng)室內(nèi)相對(duì)濕度80%和溫度(25±1) ℃。培養(yǎng)期間定期對(duì)不同處理的蛹蟲草絲菌絲體及子實(shí)體進(jìn)行觀測(cè)并記錄生長(zhǎng)狀況，對(duì)收獲后的蛹蟲草子實(shí)體的鮮重、干重、長(zhǎng)度、硒含量、腺苷及蟲草素含量等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。

1.2.3 蛹蟲草子實(shí)體中硒含量檢測(cè)方法 子實(shí)體中硒含量檢測(cè)方法參考胡婷等[22]方法。硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 mg/mL(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)，1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。將樣品于40 ℃烘干至恒重，粉碎，過100目篩。稱取0.500 0 g(精確到0.001 g)樣品于消解罐中，加入10 mL HNO3冷浸過夜，加2 mL 30% H2O2，震蕩，90 ℃恒溫水浴30 min。再次冷卻后置于微波消解儀中依次以200 W、5 min，400 W、5 min，200 W、12 min條件消解。冷卻后取出加熱至近干，加入5 mL 6 mol/L HCl，反應(yīng)完全后用超純水定容于25 mL容量瓶，待測(cè)。

1.2.4 蛹蟲草子實(shí)體中腺苷、蟲草素含量檢測(cè)方法 采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。①測(cè)定條件：C18,250 mm×4.6 mm×5 μm；流動(dòng)相：A：乙腈，B：1.0% 乙酸VA∶VB=5∶95；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm，紫外檢測(cè)器打開；進(jìn)樣量：10 μL。②標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：蟲草素、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品各取10 mg(按實(shí)際含量折算)，用流動(dòng)相(V乙腈∶V水=5∶95)定容至100 mL，搖勻。③標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)定容至10 mL，標(biāo)注曲線濃度1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL。配制不同梯度的蟲草素和腺苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，通過標(biāo)樣峰面積制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。將被測(cè)的提取液逐一高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蟲草素和腺苷的含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 本研究數(shù)據(jù)以平均值作為依據(jù)，采用SPSS軟件(Version11.5，USA)、EXCEL軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)分析

由表2可知，實(shí)驗(yàn)組1與對(duì)照組(CK)在菌絲長(zhǎng)滿時(shí)間、菌絲密度、菌絲轉(zhuǎn)色時(shí)間和菌餅變黃時(shí)間上無明顯差異，而其他組與對(duì)照組均有明顯差異。隨著培養(yǎng)基中Na2SeO4濃度的增加，蛹蟲草菌絲長(zhǎng)滿時(shí)間延長(zhǎng)，菌絲密度下降，菌絲轉(zhuǎn)色時(shí)間延長(zhǎng)。由此可見，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著Na2SeO4濃度的增加，對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生較明顯的抑制作用，實(shí)驗(yàn)組7表現(xiàn)最為明顯。

表2 不同處理蛹蟲草的菌絲生長(zhǎng)情況比較

注：“++++” 密度最好；“+++” 密度較好；“++” 密度一般；“+” 密度差

2.2 蛹蟲草子實(shí)體生長(zhǎng)分析

由表3可知，Na2SeO4質(zhì)量濃度為20 mg/L實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在出草時(shí)間、子座生長(zhǎng)、子實(shí)體生長(zhǎng)及色澤、子囊殼和出草質(zhì)量上沒有明顯差別，而其他實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均有比較明顯的差異。隨著培養(yǎng)基中Na2SeO4質(zhì)量濃度的增加，蛹蟲草出草時(shí)間延長(zhǎng)，子囊座變得短粗且不均勻，子實(shí)體形成量減少，質(zhì)量變差。由此可見，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著Na2SeO4質(zhì)量濃度的增加，對(duì)蛹蟲草菌子實(shí)體生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，濃度越高抑制作用越明顯，Na2SeO4質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)蛹蟲草子實(shí)體已不具備商品價(jià)值。

表3 不同處理蛹蟲草的子實(shí)體生長(zhǎng)情況比較

注：“++++”表示80%的子實(shí)體直徑≥ 3 mm，長(zhǎng)度≥4 cm；“+++”表示80%的子實(shí)體直徑≥2 mm，長(zhǎng)度≥3 cm；“++”表示80%的子實(shí)體直徑≥1 mm，長(zhǎng)度≥2 cm；“+”表示80%的子實(shí)體直徑<1 mm，長(zhǎng)度<2 cm

2.3 蛹蟲草出草比較

由表4可知，培養(yǎng)基中添加20 mg/L Na2SeO4的實(shí)驗(yàn)組在蟲草長(zhǎng)度、鮮重、干重、鮮干比和生物轉(zhuǎn)化率幾個(gè)指標(biāo)上與對(duì)照組都沒有顯著差異。其他實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均有顯著差異，而且除了干鮮比外其他考察指標(biāo)均隨著培養(yǎng)基中Na2SeO4質(zhì)量濃度的增加逐漸下降，當(dāng)Na2SeO4質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)蛹蟲草各項(xiàng)指標(biāo)已達(dá)到失去生產(chǎn)意義的程度。由圖1也可以明顯看出不同Na2SeO4濃度處理對(duì)蛹蟲草出草指標(biāo)的影響。

圖1 不同處理人工栽培蛹蟲草子實(shí)體效果Fig.1 Effect of different treatments on the fruiting ofCordyceps militaris

表4 不同處理的蛹蟲草子實(shí)體相關(guān)指標(biāo)分析

注：數(shù)據(jù)為平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差；不同字母表示為顯著性差異(P<0.05)，下表同

2.4 不同處理硒含量分析

由于對(duì)照組沒有添加外源硒，所以對(duì)照組在子實(shí)體硒含量對(duì)比中沒有意義。由表5可知，培養(yǎng)基Na2SeO4質(zhì)量濃度為20 mg/L和40 mg/L，實(shí)驗(yàn)組在子實(shí)體總硒含量上沒有顯著差異，其他各實(shí)驗(yàn)組之間均有顯著差異。子實(shí)體總硒含量隨著培養(yǎng)基中外源硒濃度的增加而呈逐漸遞減趨勢(shì)，當(dāng)外源Na2SeO4質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，蛹蟲草子實(shí)體中總硒含量由34.74%降為3.92%。

表5 不同處理子實(shí)體中總硒含量

2.5 不同處理腺苷、蟲草素含量分析

由表6可知，就腺苷含量來看，培養(yǎng)基Na2SeO4質(zhì)量濃度為20 mg/L和40 mg/L實(shí)驗(yàn)組子實(shí)體中腺苷含量與對(duì)照組相比差異顯著，且腺苷含量顯著提升；當(dāng)外源硒質(zhì)量濃度達(dá)到80 mg/L以上子實(shí)體中腺苷含量隨著培養(yǎng)基中外源硒濃度的增加而呈逐漸遞減趨勢(shì)，培養(yǎng)基中硒質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，腺苷含量?jī)H為505.20 μg/g。就蟲草素含量來看，與對(duì)照組相比處理1、2蟲草素含量有所增加且差異顯著，處理1、2間差異顯著；當(dāng)外源Na2SeO4質(zhì)量濃度達(dá)到60 mg/L，即處理3，子實(shí)體中蟲草素含量與對(duì)照組相比顯著下降，且隨著培養(yǎng)基中外源硒濃度的增加蟲草素含量呈遞減趨勢(shì)；當(dāng)外源Na2SeO4質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素含量為4 035.62 μg/g。

表6 不同處理子實(shí)體中腺苷、蟲草素含量

3 討 論

許多學(xué)者[6，11，16]進(jìn)行富硒蛹蟲草研究時(shí)，多以Na2SeO3作為外源硒，本研究以Na2SeO4作為硒源，通過大量人工栽培試驗(yàn)，為尋找新的硒源開辟新思路，進(jìn)一步為新疆地區(qū)大規(guī)模栽培富硒蛹蟲草提供一定的參考。研究結(jié)果表明：與對(duì)照相比，Na2SeO4質(zhì)量濃度為20 mg/L處理的蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)情況呈較好態(tài)勢(shì)，隨著培養(yǎng)基中硒濃度增加，硒對(duì)蛹蟲草菌絲體生長(zhǎng)的抑制作用更加顯著，當(dāng)Na2SeO4質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L的蟲草菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)最差。這說明較高濃度的外源硒對(duì)蛹蟲草菌絲體生長(zhǎng)有一定影響，這與于田田等[14]的研究結(jié)果一致。通過對(duì)不同濃度Na2SeO4處理的蛹蟲草子實(shí)體生長(zhǎng)狀況及生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行觀測(cè)和方差分析，發(fā)現(xiàn)隨著外源Na2SeO4濃度的增加，蛹蟲草子實(shí)體生長(zhǎng)的各項(xiàng)參考指標(biāo)均有不同程度下降，當(dāng)外源Na2SeO4質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)，蛹蟲草子實(shí)體已不具商品價(jià)值。這說明高濃度的外源Na2SeO4對(duì)蛹蟲草子實(shí)體生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，這與杜雙田等[6]、賁松彬等[23]研究結(jié)果基本一致。通過對(duì)不同濃度Na2SeO4處理的蛹蟲草子實(shí)體總硒含量進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，除20 mg/L及40 mg/L處理以外，總體上其他各處理間子實(shí)體中總硒含量均呈顯著性差異(P<0.05)。隨著培養(yǎng)基中Na2SeO4質(zhì)量濃度的增加，蛹蟲草子實(shí)體總硒含量呈下降趨勢(shì)。這與杜雙田等[6]研究結(jié)果不盡一致，可能與試驗(yàn)材料及環(huán)境條件等因素有關(guān)。通過對(duì)不同濃度Na2SeO4處理的蛹蟲草子實(shí)體中腺苷、蟲草素含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)20 mg/L處理與其他各處理間子實(shí)體中腺苷及蟲草素含量均呈顯著性差異(P<0.05)，且當(dāng)培養(yǎng)基中Na2SeO4質(zhì)量濃度達(dá)到80 mg/L以上時(shí)，蛹蟲草子實(shí)體中腺苷及蟲草素含量呈下降趨勢(shì)，這有可能是高濃度的硒影響了蛹蟲草生物代謝，其影響機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加20 mg/L Na2SeO4，對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)(菌絲密度、菌餅變黃時(shí)間、菌絲轉(zhuǎn)色情況)、蛹蟲草的子實(shí)體生長(zhǎng)(子實(shí)體形成時(shí)間、子座、出草質(zhì)量等)無明顯影響。但隨著培養(yǎng)基中Na2SeO4濃度的增加，蛹蟲草菌絲及子實(shí)體生長(zhǎng)指標(biāo)均呈明顯下降趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)基中Na2SeO4質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)與其他組相比均達(dá)到最低值，已明顯不具商品價(jià)值。通過本研究可以看出，在培養(yǎng)基中添加不超過20 mg/L質(zhì)量濃度的Na2SeO4對(duì)蛹蟲草的生長(zhǎng)不產(chǎn)生顯著的影響，是以Na2SeO4為硒源進(jìn)行蛹蟲草富硒研究的安全濃度。該研究為富硒產(chǎn)品開發(fā)尋找新的硒源開辟了新思路，為新疆地區(qū)進(jìn)一步大規(guī)模栽培富硒蛹蟲草提供一定的參考，但對(duì)以Na2SeO4為硒源的最佳富硒濃度還有待進(jìn)一步研究。