于 淼， 劉 婷， 胡 明， 王 斌， 錢冬萌*

(1.青島大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266071;2.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)系，山東 青島 266071)

人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)[1]屬于皰疹病毒家族，在人群中引起廣泛且持續(xù)的感染，腦是HCMV感染的優(yōu)先位點，可導(dǎo)致人的精神障礙或癲癇等功能障礙[2]。HCMV通過影響細胞存活、細胞周期和侵襲潛能來調(diào)控腫瘤惡性表型。轉(zhuǎn)IE2基因小鼠[3]的建立是通過DNA原核顯微注射方法，轉(zhuǎn)入的目的基因僅僅是整合在二倍體動物的其中一條染色體上，所以是半合子，它的后代只有一部分個體帶有整合的基因，有的沒有目的基因。所以，轉(zhuǎn)基因小鼠需要一個相當長的篩選和純化過程，以期獲得純合子的轉(zhuǎn)基因小鼠。HCMV感染后第一個病毒基因是即刻早期基因，基因中表達最豐富的產(chǎn)物被稱為即刻早期1和2蛋白[4](IE72和IE86)。IE86蛋白是一種強烈的反式激活因子，與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機制的因子相互作用。參與病毒和細胞啟動子反式激活的IE86蛋白在病毒調(diào)節(jié)蛋白中是獨特的，因為它可以同時負向和正向調(diào)節(jié)病毒和細胞啟動子[5]。越來越多的證據(jù)證明，轉(zhuǎn)錄激活因子5(activating transcription factor5,ATF5)[6]是一個與凋亡密切相關(guān)的因子。研究表明，在鼠膠質(zhì)瘤模型中干擾抑制ATF5的功能會引起膠質(zhì)瘤細胞的特異性凋亡，而對膠質(zhì)瘤細胞周圍的正常細胞不具有這種凋亡作用。在許多腫瘤組織中也發(fā)現(xiàn)有ATF5的高表達，例如在乳腺癌細胞中干擾抑制ATF5的表達也能引起細胞的凋亡[7]。ATF5是一個與凋亡密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在凋亡、分化及發(fā)育等生理過程中發(fā)揮著重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠與細胞 國際標準化ICR(Institute of Cancer Research)C57BL/6小鼠30只，雌性，體重18～20 g，6～8周齡；GL261小鼠膠質(zhì)瘤細胞系購自上海細胞庫。

1.1.2 試劑與儀器 胎牛血清(FBS，Hyclone)，DMEM(Hyclone)，基因組DNA提取試劑盒及組織RNA提取試劑盒(康為世紀生物科技有限公司)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，青霉素及鏈霉素(Solarbio)，Anti-ATF5 antibody(abcom)，HRP山羊抗鼠IgG；PCR儀，BIO RAD Real-time PCR儀(My-iQ Optics Module)，蛋白凝膠電泳系統(tǒng)(韋伯)，離心機，恒溫培養(yǎng)箱等。

1.1.3 PCR引物 本研究中使用的PCR引物見表1。

表1 PCR引物

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將GL261鼠膠質(zhì)瘤細胞在含有青霉素和鏈霉素的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，每3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞進行下一步實驗。

1.2.2 鼠尾鑒定 剪取長度為0.4～0.6 cm的小鼠鼠尾，分裝于1.5 mL高壓滅菌的離心管內(nèi)，加入100 μL蛋白酶k于70 ℃水浴裂解過夜，用DNA提取試劑盒提取鼠尾DNA，以此DNA作為模板，在IE2引物、酶等條件下用PCR方法進行DNA擴增，產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測目的條帶，觀察最后顯影結(jié)果，最終確定小鼠的陰性或陽性，以備后續(xù)實驗。

1.2.3 小鼠荷瘤 當細胞長成至培養(yǎng)瓶90%融合時傳代，用含有EDTA的胰酶消化細胞，消化成細胞數(shù)為1×107/mL懸浮細胞2 mL；用1 mL的注射器分別給予3個實驗組的小鼠右側(cè)腋下注射0.2 mL，對照組小鼠相同位置注射相同劑量的懸浮細胞。記錄每日觀察并稱量小鼠皮下腫瘤的生長情況。

1.2.4 腫瘤組織DNA的提取 荷瘤后短時間內(nèi)荷瘤小鼠的體重呈現(xiàn)直線生長的狀態(tài)，但是這個過程并不是持續(xù)的，待小鼠體重穩(wěn)定不再增長，并呈現(xiàn)減重現(xiàn)象時，對小鼠進行脫頸處死并解剖，并對腫瘤進行剝離，用電子天平分別稱取20～30 mg置于1.5 mL高壓滅菌的離心管內(nèi)，用滅菌的研磨杵研磨充分，用RNA提取試劑盒進行腫瘤組織的RNA提取，并以提取的RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 熒光定量PCR(qPCR) Real-time PCR采用β-actin作為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因與目的基因各設(shè)3個平行反應(yīng)管。反應(yīng)體系為20 μL，其中10 μL SYBR green mixture，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，加水至20 μL，95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，循環(huán)40次。60 ℃、30 s時讀出熒光值。

1.2.6 腫瘤組織蛋白的提取 將腫瘤組織用電子天平分別稱取20～30 mg于1.5 mL高壓滅菌的離心管內(nèi)，用滅菌的研磨杵研磨充分，加入裂解液(RIPA∶PMSF=500∶1)501 μL，最后在冰上裂解30 min，4 ℃ 13 000 r/min離心10 min，收集上清即為總蛋白。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blot) 提取的蛋白按照1∶4的比例加入5×SDS loading buffer，煮沸5 min，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，用300 mA恒電流將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用TBST配制的5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1∶2 000稀釋)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶2 000稀釋)孵育2 h，TBST清洗3次，每次10 min，加入ECL顯色液(A液∶B液=1∶1)黑暗保存5 min后顯影檢測目的蛋白的表達。

2 結(jié)果與分析

2.1 GL261小鼠膠質(zhì)瘤的細胞狀態(tài)

復(fù)蘇GL261小鼠膠質(zhì)瘤細胞，顯微鏡下觀察細胞會具有明顯的星形觸角伸出，貼壁生長24 h，生長狀態(tài)如圖1所示。繼續(xù)生長72 h至鋪滿培養(yǎng)瓶整個底部，待細胞數(shù)達到要求(一般荷瘤細胞數(shù)在106～108個/mL)，生長狀態(tài)如圖1d所示，胰酶消化細胞并用計數(shù)板計數(shù)，重懸細胞備用，用于后期對小鼠進行荷瘤。

圖1 GL261小鼠膠質(zhì)瘤細胞生長狀態(tài)Fig.1 GL261 mouse glioma cell growth statusa～d：12、24、48、72 h后細胞的生長狀態(tài)a-d: Growth status of cells after 12, 24, 48, 72 h

2.2 PCR定性鑒定IE2與ATF5

對實驗的30只標準化小鼠進行鼠尾鑒定，將鑒定后的陰性小鼠和陽性小鼠分組以便進行后續(xù)實驗，圖2顯示了5對陰性小鼠和陽性小鼠中ATF5的表達，通過電泳條帶可觀察出顯著差異。

2.3 小鼠荷瘤后腫瘤狀態(tài)

荷瘤后短時間內(nèi)荷瘤小鼠體重呈直線生長的狀態(tài)，對陰、陽性小鼠腫瘤組織體內(nèi)外形態(tài)進行對比，結(jié)果如圖3所示。圖3A為GL261膠質(zhì)瘤在小鼠體內(nèi)生長時小鼠的體表形態(tài)。選取5只陰性對照組和5只陽性實驗組(共10只)荷瘤鼠，待小鼠體重穩(wěn)定不再增長，并呈現(xiàn)減重現(xiàn)象時，對小鼠進行脫頸處死并解剖，對腫瘤進行剝離，圖3B為腫瘤剝離后的形態(tài)比較，可以觀察出明顯的狀態(tài)區(qū)別。陽性荷瘤小鼠較陰性荷瘤小鼠，腫瘤大小不論在小鼠體內(nèi)還是在體外剝離后，與對照組相比，均呈現(xiàn)顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)，陽性荷瘤小鼠的腫瘤大小整體水平較陰性荷瘤小鼠的腫瘤大。

圖2 ATF5轉(zhuǎn)錄因子的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of ATF5 transcription factorM：DNA分子量標準品，分子量大小為2 000 bp；1～10：不同PCR反應(yīng)管編號；1～5：陰性小鼠中ATF5的表達；6～10：陽性小鼠中ATF5的表達M: DNA marker, the molecular weight is 2 000 bp; 1-10: different PCR reaction tube numbers; 1-5: expression of ATF5 in negative mice；6-10: Expression of ATF5 in positive mice

圖3 腫瘤在小鼠體內(nèi)及體外的形態(tài)Fig.3 Tumorin vivoandin vitromorphology in miceA：a～c為陰性、陽性小鼠荷瘤對照比較，d為野生小鼠對照比較；B：陰性、陽性小鼠腫瘤組織體外形態(tài)比較；C：荷瘤陰陽性小鼠體重變化；+：陽性小鼠，-：陰性小鼠； ***P<0.000 1A: a-c plots are comparisons of negative-positive mouse-bearing controls, d is comparisons of wild-mouse controls; B: comparisons of tumor-in vitro morphology of negative-positive mice;C: Changes in body weight of tumor-bearing positive mice;+: positive mice,-:negative mice;***P<0.000 1

2.4 qPCR法定量檢測ATF5表達水平

選取鼠尾鑒定后的陽性鼠進行后續(xù)實驗，用熒光實時定量PCR方法定量檢測5組陽性小鼠(共10只)中ATF5的表達量，見圖4。結(jié)果顯示IE2表達與ATF5存在明顯的定量關(guān)系，呈顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，為了驗證它們之間的關(guān)系，進行了后續(xù)的Western blot實驗。

圖4 qPCR法檢測IE2與ATF5的表達量Fig.4 qPCR assay for expression of IE2 and ATF51～5：陽性荷瘤小鼠的實驗組編號，*P<0.051-5: Experimental group number of positive tumor-bearing mice, *P<0.05

2.5 蛋白免疫印跡(Western blot)法定量檢測ATF5表達水平

對選取的5只陰性對照組和5只陽性實驗組(共10只)荷瘤鼠，腫瘤組織蛋白提取繼而進行蛋白免疫印跡法檢測ATF5表達量， Western blot方法從蛋白水平檢測了ATF5與IE86蛋白之間的定量關(guān)系，實驗組為陽性荷瘤小鼠ATF5表達的平均值，對照組為陰性荷瘤小鼠ATF5表達的平均值，如圖5所示，與對照組相比，呈顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示，陽性荷瘤鼠中ATF5呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，說明在轉(zhuǎn)IE2基因小鼠中，ATF5轉(zhuǎn)錄因子起到重要的調(diào)節(jié)作用。

圖5 Western blot檢測ATF5的表達量Fig.5 Western blot detection of ATF5 expressionA：Western blot方法從蛋白水平檢測了ATF5與IE2之間的定量關(guān)系；B：a、c為陰性鼠中ATF5的表達量，b、d為陽性鼠中ATF5的表達量;*P<0.05A: The quantitative relationship between ATF5 and IE2 was detected from the protein level by Western blot; B: a, c is the expression level of ATF5 in negativity mice, b, d is the expression level of ATF5 in positive mice; *P<0.05

3 討 論

人巨細胞病毒屬于β皰疹病毒亞科，是人類皰疹病毒中最大的一組病毒[8-9]，感染率可高達100%。HCMV基因組是全長超過240 kb的雙鏈DNA，整個基因組含有250個開放閱讀框(ORF)。在病毒感染過程中， HCMV基因的表達表現(xiàn)一定的時序性，可分為早早期(IE)、早期(E)和晚期(L)基因[10-12]。病毒穿入細胞后， IE基因被宿主細胞因子激活并最早表達，編碼兩種重要的調(diào)控蛋白 IE1(IE72)和 IE2(IE86)。其中 IE2(IE86)蛋白是一種重要的反式激活因子并在HCMV感染中發(fā)揮了重要作用[13]。近年有資料證實，IE2(IE86)調(diào)節(jié)許多與控制細胞周期相關(guān)的因子。

本研究應(yīng)用到的轉(zhuǎn)IE2基因[14]小鼠，是通過DNA原核顯微注射方法，轉(zhuǎn)入的目的基因僅僅只是整合在二倍體動物的其中一條染色體上，所以是半合子，它的后代只有一部分個體帶有整合的基因,有的沒有目的基因，所以，轉(zhuǎn)基因小鼠需要一個相當長的篩選和純化過程，以期獲得純合子的轉(zhuǎn)基因小鼠。 ATF5最初是從人T淋巴細胞中分離出來[15],并在腫瘤發(fā)展中起重要作用。ATF5是具有堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)域的ATF/CREB家族的成員。ATF5轉(zhuǎn)錄因子參與DNA結(jié)合和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，并具有抗凋亡的作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)ATF5的抗凋亡功能是具有選擇性的，在對DNA損傷試劑誘導(dǎo)的凋亡過程中就沒有抗凋亡的功能。ATF5是一個與凋亡密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在凋亡、分化及發(fā)育等生理過程中發(fā)揮著重要作用[17]。

本研究以轉(zhuǎn)基因小鼠為切入點，將膠質(zhì)瘤細胞在小鼠皮下建立移植瘤模型，著重在分子水平研究IE86和ATF5[18-20]之間表達和分布的關(guān)系，結(jié)果顯示，ATF5在轉(zhuǎn)IE2基因小鼠中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，并與之存在顯著的定量關(guān)系。本研究結(jié)果為治療病毒感染以及拓展腫瘤治療與預(yù)防提供了參考。