劉月芹， 賀曉龍， 任桂梅

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

靈芝(Ganodermalucidum)別名赤芝、靈芝草、仙草、紅芝、神芝、丹芝、瑞草、神草、萬(wàn)年蕈，俗稱木靈芝。屬于擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)傘菌綱(Agaricomycetes)多孔菌目(Polyporales)靈芝屬(Ganoderma)，是熱帶、亞熱帶地區(qū)生長(zhǎng)發(fā)育的高溫型菌類(lèi)，在我國(guó)東北、華北以南地區(qū)均有分布。靈芝具有較高的營(yíng)養(yǎng)、保健和醫(yī)療價(jià)值[1]，是中國(guó)傳統(tǒng)藥用真菌，廣泛應(yīng)用于人類(lèi)各種疾病的預(yù)防和治療。靈芝含有三萜類(lèi)化合物、靈芝多糖、有機(jī)鍺、硒、核苷酸、甾醇類(lèi)、氨堿類(lèi)、多肽類(lèi)等160多種藥用活性成分。靈芝酸是靈芝三萜類(lèi)化合物，具有保肝、抗腫瘤、抗 HIV-1 及 HIV-1 蛋白酶活性、抑制組胺釋放、抑制膽固醇合成、鎮(zhèn)痛、抑制血小板聚集、抗氧化等作用[2-4]。靈芝酸含量的高低已成為衡量靈芝質(zhì)量高低的重要指標(biāo)[5]。目前對(duì)靈芝酸的研究熱度和需求不斷增加，然而靈芝酸在靈芝子實(shí)體中含量較低且靈芝生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，不利于大量生產(chǎn)及商業(yè)化應(yīng)用。近年來(lái)，靈芝液體發(fā)酵技術(shù)不僅具有培養(yǎng)周期短、易控制的特點(diǎn)，還具有連續(xù)大量生產(chǎn)活性成分的優(yōu)勢(shì)。目前的研究熱點(diǎn)主要是通過(guò)添加誘導(dǎo)子[6-13]和發(fā)酵條件優(yōu)化兩種方法來(lái)提高靈芝酸的含量。然而對(duì)于靈芝酸發(fā)酵條件的優(yōu)化研究主要集中在通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基成分、pH值、氧濃度等[14-18]方面。溫度對(duì)靈芝液體發(fā)酵的影響研究不多，為此本研究探討了較高溫度培養(yǎng)對(duì)靈芝液體發(fā)酵過(guò)程中各項(xiàng)生理指標(biāo)的影響，為靈芝酸的高效生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 靈芝菌株(G.lucidumCGMCC 5.616) 購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保存于4 ℃冰箱PDA斜面培養(yǎng)基。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①種子液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，去離子水1 000 mL，pH 5.5；②種子固體培養(yǎng)基：在種子液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加瓊脂20 g；③液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖30 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 2 g，維生素B 0.02 g，去離子水1 000 mL，pH 5.5。

1.1.3 主要試劑 3,5-二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS)，2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS)，蒽酮，濃硫酸，氯仿，NaHCO3，乙酸，乙腈。DNS和ABTS購(gòu)自Sigma公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備 超凈工作臺(tái)(VS-1300U，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；超低溫冰箱(DW-86L388，青島海爾特種電器有限公司)；恒溫干燥箱(BPG-9156A，上海一恒)；恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9902，上海一恒)；恒溫水浴鍋(HWS-26，上海一恒)；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(UV-1200，上海美譜達(dá))；組合式光照振蕩培養(yǎng)箱(ZQZY-BG，上海知楚)；高速冷凍離心機(jī)(5424，德國(guó)艾本德)；高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent1100)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方案 采用振蕩與靜置相結(jié)合的分段培養(yǎng)方案。種子液的制備：保存于4 ℃斜面培養(yǎng)基上的靈芝菌株經(jīng)活化后，重新保存于PDA平板培養(yǎng)皿中。將平皿中的菌絲用滅過(guò)菌的直徑為1 cm的打孔器取6塊定量接種于盛有45 mL種子液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、120 r/min避光振蕩培養(yǎng)7 d。發(fā)酵培養(yǎng)：將上述得到的種子液按10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于盛有90 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中，分別置于30、32、34、36 ℃恒溫?fù)u床180 r/min先振蕩培養(yǎng)2 d，然后靜置培養(yǎng)至12 d，發(fā)酵培養(yǎng)期間，每隔2 d，每個(gè)溫度下取樣3瓶，用來(lái)測(cè)量生物量﹑可溶性糖﹑胞外酶活及靈芝酸生成量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.2 生物量測(cè)定 定時(shí)取樣，用50 mL離心管收集菌絲，經(jīng)10 000×g離心20 min，沉淀下來(lái)的菌絲經(jīng)去離子水清洗3遍后放在已經(jīng)烘干至恒重的濾紙上，在50 ℃干燥箱中烘干至恒重后稱重。稱重結(jié)果減去濾紙重即為生物量。

1.2.3 可溶性糖含量檢測(cè) 可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法[19]。定時(shí)取適量發(fā)酵液，4層紗布過(guò)濾，靜止5 h，經(jīng)10 000× g離心5 min后，取1 mL上清液加入10 mL蒽酮試劑(蒽酮150 mg溶于稀硫酸100 mL(濃硫酸76 mL加水30 mL))，搖勻后置90 ℃保溫15 min，最后冷卻至室溫，620 nm測(cè)OD值。

1.2.4 胞外酶活測(cè)定 從第2天開(kāi)始，每隔2 d取樣，發(fā)酵液用50 mL離心管收集菌絲，經(jīng)10 000× g離心20 min后，上清液即為粗酶液。得到粗酶液后進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)缓髮?duì)淀粉酶﹑羧甲基纖維素酶及漆酶酶活進(jìn)行測(cè)定。連續(xù)測(cè)定6次。淀粉酶酶活用DNS法測(cè)定，1個(gè)酶活單位(1U)定義為在pH 5.6、40 ℃條件下，每分鐘生成1 μmol麥芽糖所需的酶量[20]。羧甲基纖維素酶活性用DNS法測(cè)定，1個(gè)酶活單位定義為在50 ℃，相應(yīng)pH條件下，每分鐘生成1 μmol葡萄糖所需的酶量[20]。漆酶酶活采用ABTS法測(cè)定，1個(gè)酶活單位定義為反應(yīng)體系中每分鐘使ABTS溶液產(chǎn)生1 μmol ABTS自由基的酶量[20-21]。

1.2.5 靈芝酸提取與測(cè)定 取適量發(fā)酵液，經(jīng)10 000×g離心5 min后，取上清液，使其在50 ℃下真空濃縮至膏狀，得到提取物浸膏，并用氯仿溶解，反復(fù)用水萃取6次，取氯仿層，然后再用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaHCO3溶液進(jìn)一步萃取3次，取NaHCO3萃取層，用2 mol/L HCl 調(diào)節(jié)NaHCO3萃取液pH<3。最后，沉淀物再用氯仿溶解，真空薄膜旋蒸，濃縮至干成固體粉末，得到粗靈芝酸。靈芝酸含量的測(cè)定采用HPLC法[18，22]，測(cè)定條件為色譜柱Agilent Hpersil (5 μm×4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：V2%乙酸∶V2%乙腈=7∶3；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)均用mean±SD表示。利用SPSS15.0進(jìn)行方差分析，多重比較不同溫度下的顯著性差異。P< 0.05為有顯著差異；P<0.01為有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)的影響

靈芝屬高溫性菌類(lèi)，根據(jù)靈芝的適應(yīng)溫度生長(zhǎng)范圍設(shè)置了30、32、34、36 ℃四個(gè)溫度，詳細(xì)探討較高溫度發(fā)酵對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，30 ℃下靈芝菌絲的生長(zhǎng)狀況最好，然而隨著發(fā)酵溫度的升高，其生物量呈下降的趨勢(shì)；32和34 ℃培養(yǎng)溫度下不同培養(yǎng)時(shí)間的生物量相比對(duì)照組(30 ℃)有一定的降低，但差異不明顯；36 ℃培養(yǎng)溫度下不同培養(yǎng)時(shí)間的生物量相比對(duì)照組普遍降低了30%以上，差異顯著(P<0.05)。34 ℃下的生物量比32 ℃下的稍低，但差異不明顯，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而36 ℃下的生物量相比于34 ℃(P=0.048 22)和32 ℃下的生物量(P=0.041 34)差異顯著，下降明顯，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)從表1可以發(fā)現(xiàn)，在第10 天不同發(fā)酵溫度下的生物量達(dá)到最大值，而隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至12 d，其生物量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

表1 不同發(fā)酵溫度下的靈芝生物量

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同行不同小寫(xiě)字母表示相同培養(yǎng)時(shí)間不同培養(yǎng)溫度在0.05水平存在顯著差異，下圖表同

2.2 溫度對(duì)靈芝幾種胞外酶活的影響

溫度是影響酶活的一個(gè)重要因素，而微生物最適生長(zhǎng)溫度并不等于最適發(fā)酵溫度，也不等于積累代謝物的最適溫度。較高的發(fā)酵溫度會(huì)提高細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶的酶活，從而一定程度上提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。基于此，研究了較高溫度對(duì)靈芝液體發(fā)酵中幾種胞外酶的酶活影響。由表2可知，淀粉酶酶活隨著發(fā)酵溫度的升高而提高。32 ℃培養(yǎng)條件下，除了第10天的淀粉酶酶活相比對(duì)照組有顯著提高外(P<0.05)，其他不同培養(yǎng)時(shí)間的酶活提無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。34 ℃培養(yǎng)條件下，從第6天開(kāi)始，淀粉酶酶活相比對(duì)照提高了30%以上，差異顯著(P<0.05)。36 ℃培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)時(shí)間的淀粉酶酶活相比對(duì)照提高了25%～70%，差異顯著(P<0.05)。雖然36 ℃下的淀粉酶酶活高于34 ℃，但兩溫度下的酶活差異不顯著。結(jié)果表明，較高的發(fā)酵溫度可提高淀粉酶的酶活。同時(shí)，從表2中可以發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的第4天，不同培養(yǎng)溫度條件下，其淀粉酶的酶活是最高的。但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其酶活逐漸降低。這一研究與陳國(guó)梁等[23]及楊舒貽等[24]對(duì)于淀粉酶活性變化趨勢(shì)相一致。馬鈴薯富含淀粉，淀粉是靈芝菌絲生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)源。所以在發(fā)酵前期，菌絲的生長(zhǎng)需要淀粉酶的高酶活將淀粉分解成可溶性糖從而滿足菌絲對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的需要。但隨著菌絲的快速生長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的淀粉被慢慢消耗，從而影響到菌絲的進(jìn)一步生長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致酶活的下降。而在相同培養(yǎng)條件下，漆酶和纖維素酶酶活卻呈現(xiàn)出隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)先升高再降低的現(xiàn)象(表3、表4)。漆酶是與木質(zhì)素降解有關(guān)的氧化酶，降解的木質(zhì)素為菌絲提供營(yíng)養(yǎng)[25]。漆酶在培養(yǎng)前期酶活很低，且增長(zhǎng)比較緩慢。32 ℃培養(yǎng)條件下，2～8 d培養(yǎng)時(shí)間里漆酶的酶活相比對(duì)照組有顯著提高(P<0.05)，34 ℃培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)時(shí)間的漆酶酶活相比對(duì)照組提高了50%～200%，差異顯著(P<0.05)。36 ℃下的漆酶酶活雖然低于34 ℃，除了第4天的酶活下降顯著外，其他培養(yǎng)時(shí)間酶活降低不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。纖維素酶前期的酶活比漆酶酶活要高，32 ℃培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)時(shí)間的纖維素酶酶活相比對(duì)照組無(wú)顯著性提高。34 ℃培養(yǎng)條件下，2～10 d培養(yǎng)時(shí)間里的纖維素酶酶活相比對(duì)照組提高了25%～75%，差異顯著(P<0.05)。36 ℃發(fā)酵條件下的酶活相比34 ℃下的酶活有明顯下降，除了發(fā)酵的第10天，纖維素酶酶活相比對(duì)照組有顯著下降外(P<0.05)，其他培養(yǎng)時(shí)間兩溫度下的纖維素酶酶活差異不顯著。同時(shí)，從表3和表4中還可以發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵的第10天，各培養(yǎng)溫度下的漆酶和纖維素酶酶活達(dá)到最大，第12天酶活都普遍下降。這可能是菌絲生長(zhǎng)前期所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是淀粉，對(duì)于木質(zhì)素﹑纖維素的分解利用比較低，而后隨著淀粉酶活性的降低，淀粉含量減少，這時(shí)為滿足菌絲的繼續(xù)生長(zhǎng)，為其提供豐富的營(yíng)養(yǎng)，漆酶和纖維素酶的活性就會(huì)升高。以上結(jié)果表明34 ℃發(fā)酵溫度更有利于漆酶﹑纖維素酶發(fā)揮酶活。

表2 不同發(fā)酵溫度下的淀粉酶活性

表3 不同發(fā)酵溫度下的漆酶活性

表4 不同發(fā)酵溫度下的羥甲基纖維素酶活性

2.3 溫度對(duì)靈芝可溶性糖含量的影響

溫度會(huì)影響胞外酶的酶活，而酶活的高低直接影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解利用。如圖1所示，隨著培養(yǎng)溫度的升高和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同發(fā)酵溫度下的可溶性糖含量均呈先升高再降低的趨勢(shì)，這與漆酶﹑纖維素酶酶活變化規(guī)律一致。32 ℃培養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)時(shí)間的可溶性糖含量相比對(duì)照組有一定的提高，但無(wú)顯著性差異，而34和36 ℃發(fā)酵溫度下的可溶性糖含量明顯高于對(duì)照組，且差異顯著(P<0.05)。從圖1中還可以發(fā)現(xiàn)，36 ℃培養(yǎng)條件下的可溶性糖含量相比34 ℃下的含量有一定的降低，但兩溫度下的可溶性糖含量無(wú)顯著性差異，而且36 ℃培養(yǎng)條件下的可溶性糖含量仍高于30、32 ℃，且34 ℃發(fā)酵溫度下的可溶性糖含量在第10天達(dá)到最高，比對(duì)照組的可溶性糖含量提高了45.13%，差異顯著(P<0.05)。雖然在培養(yǎng)的第10天淀粉酶的酶活不是很高，但是漆酶和纖維素酶的酶活都達(dá)到最高，這樣可能導(dǎo)致了可溶性糖的含量也最高。同時(shí)結(jié)合表1，可以發(fā)現(xiàn)可溶性糖含量最高時(shí)對(duì)應(yīng)的靈芝菌絲體的生物量也是最高的。

圖1 不同發(fā)酵溫度下的可溶性糖含量Fig.1 The soluble sugar content of different fermentation temperatures

2.4 溫度對(duì)靈芝酸生物合成的影響

溫度會(huì)影響微生物的新陳代謝，通過(guò)改變代謝途徑中的酶活從而影響代謝產(chǎn)物的含量。由上述較高溫度發(fā)酵對(duì)靈芝幾種胞外酶活性的研究表明，在一定的溫度范圍內(nèi)會(huì)一定程度上提高各種代謝酶的酶活。由圖2可見(jiàn)，隨著培養(yǎng)溫度的升高和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同發(fā)酵溫度下的靈芝酸含量都在第10天達(dá)到最高，而后呈現(xiàn)再降低的現(xiàn)象，這一趨勢(shì)與前述的可溶性糖含量﹑漆酶和纖維素酶酶活變化規(guī)律一致。而且32、34、36 ℃發(fā)酵溫度下第10天靈芝酸的含量比對(duì)照組分別提高了8.21%、13.21%、3.73%。發(fā)酵第12天，32、34 ℃發(fā)酵溫度下靈芝酸含量比對(duì)照組分別提高了13.41%、20.58%，而36 ℃發(fā)酵條件下靈芝酸含量卻低于對(duì)照組。32和36 ℃培養(yǎng)條件下，不同發(fā)酵時(shí)間靈芝酸產(chǎn)量雖然高于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異，而34 ℃培養(yǎng)條件下的不同發(fā)酵時(shí)間靈芝酸產(chǎn)量相比對(duì)照組均有明顯提高且差異顯著(P<0.05)。結(jié)合上述較高溫度發(fā)酵對(duì)靈芝液體發(fā)酵過(guò)程中生物量﹑胞外酶及可溶性糖含量的研究表明，在培養(yǎng)第10天，靈芝生物量﹑可溶性糖含量及胞外酶酶活均達(dá)到最高，靈芝酸含量也達(dá)到了最高值。靈芝酸是次級(jí)代謝產(chǎn)物，在發(fā)酵的第12天，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，生物量降低等原因使靈芝酸呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)如果發(fā)酵溫度太高，生物量和胞外酶活都不高，就可能導(dǎo)致靈芝酸產(chǎn)量下降。所以適合的發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間是提高靈芝酸產(chǎn)量的有效方法。

圖2 不同發(fā)酵溫度下的靈芝酸產(chǎn)量Fig.2 The ganoderic acid yield of different fermentation temperatures

3 討 論

溫度是影響靈芝生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因素，可顯著影響靈芝活性成分的含量變化[26]。而目前的研究主要集中于溫度對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)、子實(shí)體產(chǎn)量及營(yíng)養(yǎng)代謝的影響[27-28]。對(duì)于溫度對(duì)靈芝液體深層發(fā)酵培養(yǎng)特性及相關(guān)活性成分的研究很少[29-30]。微生物細(xì)胞內(nèi)的代謝酶一般需要在較高溫度下才能發(fā)揮到最佳酶活，這一溫度多半情況下是高于微生物最適生長(zhǎng)溫度的，而代謝酶酶活的提高有利于代謝產(chǎn)物的高效合成。本研究發(fā)現(xiàn)，30 ℃(對(duì)照組)培養(yǎng)條件下的菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)最好，隨著發(fā)酵溫度的升高和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，靈芝菌絲生物量有明顯下降，尤其是36 ℃培養(yǎng)條件下，其生物量比對(duì)照組下降了30%以上。這表明發(fā)酵溫度過(guò)高會(huì)嚴(yán)重影響菌絲的生長(zhǎng)，與汪金萍等[30]的研究結(jié)果一致。在整個(gè)發(fā)酵期間，較高的發(fā)酵溫度提高了靈芝胞外酶的酶活。淀粉酶的最高酶活出現(xiàn)在36 ℃發(fā)酵條件下的第4天，漆酶和纖維素酶的最高酶活出現(xiàn)在34 ℃發(fā)酵條件下的第10天。魏巍等[28]的研究表明隨著培養(yǎng)溫度的升高，靈芝的漆酶和纖維素酶的酶活也不斷提高，較高的溫度有利于酶的分泌。所以我們可以得出較高溫度發(fā)酵提高了靈芝相應(yīng)代謝酶的酶活。而可溶性糖和靈芝酸含量變化與胞外酶酶活密切相關(guān)，酶活的提高使兩者的含量也相應(yīng)提高。魏巍等[28]的研究也表明隨著培養(yǎng)溫度的提高，不同基質(zhì)部位的總糖含量一直呈升高趨勢(shì)?？扇苄蕴呛挽`芝酸含量最高在34 ℃發(fā)酵條件下的第10天，比對(duì)照組的可溶性糖含量、靈芝酸產(chǎn)量分別提高了13.21%、45.23%。隨著發(fā)酵溫度的進(jìn)一步升高和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)都會(huì)使可溶性糖含量、靈芝酸產(chǎn)量降低。這可能是由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和一些副產(chǎn)物的生成所致。

本研究證實(shí)液體培養(yǎng)條件下，溫度對(duì)靈芝的生長(zhǎng)發(fā)育及代謝調(diào)控有顯著影響，較高的溫度提高了靈芝代謝酶的酶活和相應(yīng)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，且靈芝生物量高并不代表其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量也高。對(duì)于靈芝酸的發(fā)酵生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，可能較高溫度的發(fā)酵提高了靈芝酸合成途徑中相關(guān)酶的酶活從而更有利于靈芝酸的生物合成。這為靈芝酸的代謝調(diào)控及高效合成提供了新的思路和方法。