方士元， 謝 晶

(1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術服務平臺，上海 201306；4.食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海 201306)

隨著人們生活水平和保健意識的提高，魚類因其營養(yǎng)價值更符合人體需要而日益受到青睞。其中海水魚肉質鮮美，富含EPA、DHA等不飽和脂肪酸，較淡水魚更受人們喜愛。但海水魚營養(yǎng)豐富，適宜微生物生長繁殖，更易腐敗變質，貨架期短[1-2]，延長海水魚貨架期主要依靠控制微生物的生長繁殖。保藏海水魚除了常規(guī)的物理、化學手段，還有生物保鮮法。生物保鮮技術包括用植物源性、動物源性、微生物源性和酶類生物保鮮劑以及復合生物保鮮劑保鮮[3]。近年來，微生物保鮮劑由于其高效、安全和良好的拮抗作用成為生物保鮮技術的研究熱點[4]。乳酸菌是一種微生物保鮮劑，且一般被認為是食品級微生物[5]，常用于制造酸奶、泡菜和其他發(fā)酵食品。乳酸菌生成的有機酸、細菌素和H2O2等物質能有效抑制和殺滅食品中的腐敗菌和病原菌，延長食品保質期，因而可以被用作生物保鮮劑。例如，乳酸菌產(chǎn)生的細菌素對革蘭陽性菌有很強殺滅作用，僅在低濃度下就可使其迅速死亡。其中研究最廣泛的是乳酸鏈球菌素(Nisin)，是國際上第一個被允許使用的細菌素。以往乳酸菌主要應用于乳制品和果蔬產(chǎn)品保鮮，近年來，將其應用于海水魚保鮮已逐漸成為研究熱點。本文綜述了海水魚源的乳酸菌細菌素分類、分離純化方法、保鮮機理，以及在海水魚中的應用和安全監(jiān)管問題，旨在為今后進一步關注和研究乳酸菌生物保鮮劑在海水魚中的應用提供參考。

1 乳酸菌及其細菌素概述

1.1 海水魚中的乳酸菌

乳酸菌是指一類無芽胞、革蘭陽性細菌的總稱。主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、肉食菌屬(Carnobacterium)和乳球菌屬(Lactococcus)等[6]。乳酸菌廣泛分布在自然界中，其中海水魚是乳酸菌的重要來源之一。前人從生鮮海水魚中分離得到的乳酸菌有乳桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬、明串珠菌屬等[7]。而海水魚加工產(chǎn)品一般有微加工海產(chǎn)品和半加工海產(chǎn)品，在微加工海產(chǎn)品中的優(yōu)勢乳酸菌包括乳桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬和肉食桿菌屬等[8]，其中在-15～-20 ℃貯藏的微加工海產(chǎn)品中優(yōu)勢乳酸菌是肉食桿菌屬[9]。在半加工海產(chǎn)品中的乳酸菌主要是乳酸桿菌屬和片球菌屬。

1.2 細菌素定義

細菌素(bacteriocin)是指細菌代謝過程中產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽或蛋白質復合物[10]。一般來說，乳酸菌的細菌素是陽離子的，有兩親性、膜滲透性的多肽。Klaenhammer在1993年根據(jù)乳酸菌細菌素結構和分子量將其分為四類，過去的20 a中分類標準不斷被修訂[11-12]。而Cotter等[13]在2005年將細菌素分為兩類：含有羊毛硫氨酸的羊毛硫抗生素和不含羊毛硫氨酸的非羊毛硫抗生素。Cotter認為Klaenhammer分類法的Ⅰ、Ⅱ類細菌素都是通過在細胞膜上形成孔洞或阻礙細胞壁合成來產(chǎn)生抑菌效果，Ⅲ類細菌素則是通過水解細菌細胞壁使細菌死亡，而Ⅳ類細菌素至今未發(fā)現(xiàn)，所以Cotter將乳酸菌產(chǎn)生的細菌素分為兩類。而Cotter的命名法很好地解釋了Nisin為什么具有雙重作用，即它不僅能在細胞膜上產(chǎn)生細孔，同時也能結合類脂Ⅱ阻礙細胞壁的合成；但這種分類方法目前還未得到廣泛認可，而且除了Ⅱa類細菌素之外，其他細菌素抑菌機理的研究仍較少。今后乳酸菌細菌素分類仍需不斷完善，相信隨著對其作用機制研究的日益深入，細菌素作為生物保鮮劑的應用也會越來越廣。

1.3 乳酸菌細菌素的分離純化

要研究乳酸菌素的作用機制，高純度的乳酸菌素是必不可少的。針對不同產(chǎn)品設計特異的純化技術流程，要綜合考慮純化活性、產(chǎn)率以及成本等因素，以取得良好的分離純化效果。趙冬兵[14]將清酒乳桿菌Lactobacillussakei產(chǎn)生的細菌素通過硫酸銨分級沉淀法、纖維素DEAE-52、葡聚糖G-50柱層析和高效液相色譜法進行純化，純度達97.5%。張瑜[15]分離鼠李糖乳桿菌L.rhamnosus所產(chǎn)細菌素時，用乙酸乙酯萃取，通過AKTA蛋白純化系統(tǒng)的多肽分離柱分離，制備液相獲得細菌素的純度達95%。Saraniya等[16]研究了印度發(fā)酵食品中的戊糖乳桿菌L.pentosusSJ65所產(chǎn)細菌素，用丙酮沉淀、凝膠滲透、疏水色譜等多種方式分離純化，細菌素由分子量為1.6 kDa和3.9 kDa的兩個獨立的肽組成。Casaburi等[17]對意大利傳統(tǒng)發(fā)酵香腸中的彎曲乳桿菌L.curvatus54M16所產(chǎn)細菌素經(jīng)反向液相色譜純化，解析電離飛行時間質譜后得出其分子量為2.5 ku。

2 乳酸菌保鮮的機理

在自然界中，乳酸菌通過競爭和拮抗作用抑制其他微生物生長。其中乳酸菌的拮抗作用主要是憑借了它產(chǎn)生的抗菌性代謝產(chǎn)物(有機酸、H2O2)和細菌素，抑制了其他微生物的生長繁殖，從而延長了食品保質期。

2.1 有機酸

在代謝過程中，乳酸菌會生成乳酸、乙酸等有機酸，它們顯著降低環(huán)境中的pH值，抑制有害細菌增殖，但對乳酸菌自身生長沒有影響，同時由于乳酸菌的生長繁殖，競爭作用使大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌生長受到抑制。有機酸有解離和未解離兩種形式，其抑菌能力與是否解離有關[18]，未解離的有機酸能通過自由擴散進入細菌，在其體內解離釋放質子，降低了細胞內的pH值，而細菌需要消耗大量能量來維持pH值平衡，使其能量耗盡而死；同時有機酸的解離使細胞內酸性離子不斷積累，增大胞內滲透壓，使細菌細胞破裂。此外，有機酸的解離會鈍化或變性細胞內某些酶，影響大分子物質的合成，使細菌的代謝與生長繁殖受到抑制。研究發(fā)現(xiàn)，細胞介質的pH值、酸的解離度、酸的濃度是有機酸抑菌活性的重要影響因素[19-22]。

2.2 細菌素

由于細菌素對人體無害，也不像抗生素會產(chǎn)生抗性，可以作為良好的食品保鮮劑[23]。乳酸菌產(chǎn)生的細菌素對大多數(shù)革蘭陽性菌抑制效果較好，而且若結合螯合劑使用則對革蘭陰性菌也有抑制作用[24]。同時，需要注意的是，細菌素一般只在較小的pH范圍內有活性，細菌素所帶電荷對其活性影響也很大，因而研究哪些因素會影響乳酸菌細菌素的活性就顯得十分必要[25-28]。近幾年，研究最多的乳酸菌細菌素是Nisin，它帶正電荷，具有疏水性，易與其他種細菌的細胞質膜上陰離子結合，引起膜上的類脂破壞，導致細胞膜上產(chǎn)生細孔，并進一步引起細胞內的K+、ATP等小分子迅速外流，破壞跨膜電勢，導致細菌細胞死亡[29]。它不僅能夠有效抑制革蘭陽性菌的營養(yǎng)細胞，也能殺滅其芽胞，且對芽胞的作用效果更佳[30]，是一種高效的天然保鮮劑。

2.3 H2O2

乳酸菌有黃素蛋白氧化酶活性，能生成H2O2，但是不含過氧化氫酶，使H2O2不斷累積。H2O2是一種強氧化劑，對細胞壁有強氧化作用及對核酸和蛋白質有破壞作用，在一定濃度能夠抑制或殺滅假單孢菌屬、沙門氏菌屬等革蘭陰性菌。同時，氧的濃度、介質的形態(tài)和溫度是影響H2O2產(chǎn)生的重要因素，一般在較低溫度，較高氧濃度的液態(tài)或半液態(tài)的介質環(huán)境生成H2O2數(shù)量大[31-32]。Suigita等[33]研究了從日本鯰魚腸道內分離得到的乳酸乳球菌L.lactis，發(fā)現(xiàn)其生成的有抑菌效果的物質主要是H2O2。而Harp[34]發(fā)現(xiàn)食品中有H2O2酶會破壞乳酸菌產(chǎn)生H2O2的能力。通過對上述機理的研究，表明在對海水魚中乳酸菌進行保護性培養(yǎng)時，要注意為其產(chǎn)生抑菌活性物質提供有利條件，且在不同種類海水魚中，起主要抑菌作用的物質不盡相同，需要進一步實驗研究以獲得最佳貯藏工藝。

3 乳酸菌及其細菌素在海水魚保鮮中的應用

乳酸菌能夠在低溫、低pH值、高鹽等極端條件下生長繁殖[35]，所以冷藏、腌制、鹽浸、煙熏、發(fā)酵水產(chǎn)品往往含有大量乳酸菌。之前對乳酸菌保鮮研究主要集中于其在鮭魚的應用，且主要作用病原菌為單增李斯特菌[36-41]，對它抑制效果良好。但前人研究冷藏鮭魚中微生物種類[42]時發(fā)現(xiàn)，鮭魚經(jīng)真空包裝冷藏三周后，檢測其微生物種類，其中乳酸菌屬占60%，其余40%為革蘭陰性菌，乳酸菌主要抑制革蘭陽性菌，對革蘭陰性菌的抑菌效果不佳,所以在實際應用中與其他保鮮劑聯(lián)合使用更佳。Ghalfi等[43]研究發(fā)現(xiàn)，把彎曲乳桿菌L.curvatusCWBI-B28菌株產(chǎn)生的細菌素噴涂到熏制鮭魚上，并用塑料薄膜包裝4 ℃貯藏，李斯特氏菌Listeriamonocytogenes被有效抑制。Gómez[44]用乳酸菌L.atusBCS35對鱈魚和比目魚進行保護性培養(yǎng)保鮮，NaCl濃度的3%，貯藏于聚苯乙烯盒，0～2 ℃保藏14 d，細菌數(shù)明顯低于未處理的對照組。

復合乳酸菌是指將兩種或兩種以上的乳酸菌共同培養(yǎng)，一般其抑菌效果優(yōu)于單一乳酸菌。Vescovo等[45]在冷凍煙熏鮭魚中單獨或者聯(lián)合接種干酪乳桿菌L.casei、植物乳桿菌L.plantarum和棲魚肉桿菌Carnobacteriumpiscicola，4 ℃冷藏30 d，結果表明,無害李斯特氏菌L.lnnocua受到有效控制，產(chǎn)品質量良好。Speranza等[46]將鳳尾魚注射乳酸菌和雙歧桿菌后腌制，在稀釋的鹽水中4 ℃貯藏，至少在6～10 d內有較高的感官質量，保質期超過了21 d。唐文靜等[47]研究了復合乳酸菌(干酪乳桿菌LC1+植物乳桿菌LP1+乳酸菌L3)對冷藏海鱸魚塊的保鮮效果，在4 ℃冷藏條件下，接種復合乳酸菌的海鱸魚塊較對照組的貨架期顯著增加，感官品質劣變延緩了6 d，TVB-N值的升高延緩2 d，顯著強于單一乳酸菌。

Nisin是乳酸菌產(chǎn)生的一種目前唯一被允許用作食品添加劑的細菌素，許多研究證明了它對腐敗菌和致病菌的抑制作用[48]，在海水魚保鮮方面有很大潛力。祝銀等[49]用0.4 g/L的Nisin處理金槍魚，-18 ℃凍藏，處理組肌肉的硬度、彈性和凝聚性明顯高于對照組，且在第30 天仍保持一級鮮度。裘帥波等[50]研究發(fā)現(xiàn)，采用0.5 g/L Nisin保鮮液處理后的青占魚，在4 ℃貯藏第8天，感官品質變化不大，且比照組延長了4～5 d的貨架期。盡管Nisin能很好地抑制李斯特菌等腐敗菌的生長，且不會對魚肉組織造成損傷，但只用其保鮮水產(chǎn)品仍存在一些不足。它溶解度低、易擴散到水相，單獨使用時會與酶和磷脂類成分發(fā)生反應，降低作用濃度，且對革蘭陰性菌抑制效果較差。而如果將Nisin與酸味劑、鹽等聯(lián)合使用，其抑菌范圍和抗菌活性可以得到大幅增強。官愛艷等[51]以配比為竹葉抗氧化物0.3 g/L、茶多酚0.4 g/L、Nisin 0.7 g/L配制復合生物保鮮劑，能將冰藏條件下海鱸魚的貨架期延長6 d。Abdollahzadeh等[52]用0.8%百里香酚和500 IU/g Nisin處理銀鯉樣品，在4 ℃冷藏第2天將單增李斯特菌數(shù)量降低至2 Log cfu/g以下。

將高分子物質與保鮮劑結合，可以增加被包封物質的穩(wěn)定性，免受食品成分的干擾和酶的破壞。此外，高分子物質可以使保鮮劑緩慢釋放出來，達到延長保鮮效果的目的。Concha等[53]在海藻酸鹽基質中加入乳酸菌和Nisin(100 IU/mL)制成薄膜，覆蓋在接種了單增李斯特菌的冷熏鮭魚片(4.0 cm×4.0 cm)上，4 ℃真空包裝貯藏，抑菌物質擴散到食品內，20 d內有效地抑制了李斯特菌的擴散，直徑8 mm膜的抑菌區(qū)域為5.7 cm2，說明細菌素與包裝材料相結合可能有更好的保鮮效果。凡玉杰等[54]用Nisin 0.3 g/L、殼聚糖5 g/L、海藻酸鈉7 g/L復合保鮮液處理銀鯧魚，在4 ℃冷藏的貨架期延長了約7 d。但將這些物質直接噴涂到食品表面，會出現(xiàn)分散不均勻的現(xiàn)象，也會增加表面水分含量，影響保鮮效果。

前人已經(jīng)篩選出多種具有良好抑菌活性的乳酸菌，但針對不同魚類和保藏環(huán)境，篩選工作仍在繼續(xù)。研究表明，乳酸菌在海水魚常規(guī)貯藏條件下仍能良好繁殖，抑菌成分在室溫下保持穩(wěn)定，并能顯著提高海水魚感官質量，且冷鏈斷鏈時仍能具備抑菌效果。目前, 海水魚中使用的保鮮劑正由化學型轉變?yōu)樘烊粺o毒的生物型保鮮劑, 相信在今后的研究中, 乳酸菌及其細菌素將會發(fā)揮越來越重要的作用。

4 乳酸菌保鮮應用的食品安全問題

在食品中使用如細菌素等抑菌物質，是有嚴格的監(jiān)管要求的，需要考慮它們對食品營養(yǎng)和感官特征的影響。在我國，《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》(GB 2760-2014)規(guī)定，乳酸菌素用于食用菌和雜糧罐頭、醬和復合調味料，最大使用量為0.2 g/kg；用于乳及乳制品、熟肉制品和熟制水產(chǎn)品，最大使用量是0.5 g/kg。雖然大部分乳酸菌是食源性的，可以直接使用對人體無害，但許多研究也表明[55]，乳酸菌對多種抗生素具有不同程度的抗性，而乳酸菌的抗性基因有可能會轉移給腸道內其他細菌，甚至致病菌，使其產(chǎn)生抗藥性，這是今后在使用乳酸菌時需要特別注意的方面。此外，還需注意雖然不同乳酸菌會產(chǎn)生不同生物胺(酪胺、組胺)，但一般不會達到過量的程度，反之，乳酸菌還能抑制其他產(chǎn)生物胺的微生物生長繁殖，因而控制了生物胺的生成[56-57]。如需進一步減少生物胺的含量，可以將乳酸菌與一些葡萄球菌聯(lián)用，或者篩選不產(chǎn)生物胺的乳酸菌株作為保鮮劑。

目前已知的乳酸菌產(chǎn)生的細菌素有40余種，其中Nisin被國際公認是天然、安全的食品保鮮劑，我國也許可將Nisin作為食品保鮮劑。一些安全性研究表明，人體每日攝入Nisin量不超過2.9 mg/人的情況下是安全的。而且Nisin易被蛋白水解酶水解，在腸道中很快被水解為氨基酸，在人體中無殘留，對食品的感官不產(chǎn)生有害影響。但目前除了Nisin, 其他細菌素仍缺乏安全性評價認證，有待進一步研究。同時，要使用這種新型保鮮劑，完善、合理安全的監(jiān)管體制是必不可少的。

5 展 望

隨著生活水平的提高，人們對水產(chǎn)品的質量和安全有了更高的要求。利用乳酸菌這種天然微生物作為保鮮劑，既可以達到保鮮的目的, 又能夠維持并改善其風味。但乳酸菌株遺傳特性不穩(wěn)定，無法大量培育，目前急需相應的乳酸菌制劑制造業(yè)隨之發(fā)展，才能廣泛應用于市場。此外，乳酸菌培養(yǎng)液黏度較低，無法在魚樣上形成液膜，導致處理過的魚樣汁液流失率較高，可以適當添加黏稠劑形成液膜。限制乳酸菌素資源開發(fā)的關鍵技術是純化流程，對乳酸菌素的純化流程依據(jù)細菌素的性質多采用綜合純化技術,以便高效地獲得純品。乳酸菌素與其他保鮮劑聯(lián)用有更好的保鮮效果，但產(chǎn)生協(xié)同增效的機理還有待進一步研究，可以在分子水平上進一步研究其代謝通路，為將來實際應用打下基礎。另外，將復合保鮮劑與傳統(tǒng)的保鮮技術如低溫保鮮和氣調保鮮等結合起來，可以在提高保鮮效果的前提下降低生產(chǎn)成本。雖然Nisin的保鮮效果良好，但它的穩(wěn)定性容易受到pH、鹽和溫度等物化因素的影響，有研究[58]認為葡聚糖和海藻糖對Nisin有較強的保護作用，金屬離子會提高 Nisin的抗菌活性。目前，為了增加乳酸菌及其細菌素的產(chǎn)量，可以采用新興育種技術和群體感應技術，改善遺傳性狀，調節(jié)代謝，以及高產(chǎn)菌株篩選、發(fā)酵條件調控、基因工程技術、誘導調控和脅迫刺激應答等方法，增加遺傳穩(wěn)定性，提高產(chǎn)量，為后續(xù)工業(yè)化發(fā)展奠定基礎?？傊?，隨著研究的深入，乳酸菌及其細菌素作為天然、無害的新型保鮮劑會有廣闊的應用前景。