李顏桃,張 雷,2,張明璀,王婷婷,唐 濤,馬 躍,3,4,曹立亭,3,4

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,重慶 榮昌 402460；2.貴州省畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)農(nóng)牧局,貴州 畢節(jié) 551700；3.重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心,重慶 榮昌 402460；4.西南大學(xué)中獸醫(yī)藥研究所,重慶 榮昌 402460)

川續(xù)斷是川續(xù)斷科(Dipsacaceae)川續(xù)斷屬(Dipsacus)植物川續(xù)斷(Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai)的干燥根,主要分布于中草藥資源豐富的四川等地,其性微溫,味苦辛,歸肝、腎經(jīng),具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨和調(diào)血脈等功效[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將其被列為上品,記載本品主傷寒,補(bǔ)不足,金瘡,癰瘍,折跌,續(xù)筋骨,婦人乳難,久服益氣力；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,續(xù)斷具備增強(qiáng)免疫力、抗氧化、消炎、抗病毒等藥理作用；臨床上常用于治療肝腎不足、腰肢痿軟、筋傷骨折、胎動(dòng)不安等疾病。川續(xù)斷化學(xué)成分較復(fù)雜,主要含有的化學(xué)成分為揮發(fā)油類、生物堿類、環(huán)烯醚萜類、三萜皂苷類[2]。已有研究證實(shí)[3],川續(xù)斷水煎液經(jīng)離心醇沉后得到的多糖具備刺激淋巴細(xì)胞的抗補(bǔ)體活性和致有絲分裂的作用；石扣蘭[4]研究表明,一定劑量川續(xù)斷水煎劑灌胃可提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能；趙連根[5]研究表明,川續(xù)斷對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)有抑制的作用,可使免疫抑制小鼠血中的白細(xì)胞總數(shù)恢復(fù)到正常水平。王一濤[6]研究表明,川續(xù)斷能顯著增強(qiáng)機(jī)體體液免疫功能,對(duì)機(jī)體單核吞噬細(xì)胞功能有一定促進(jìn)作用。

據(jù)以往研究,川續(xù)斷對(duì)骨損傷、骨質(zhì)疏松、成骨細(xì)胞增殖及免疫功能、抗炎抗過敏、子宮增重等具有影響。近年來國內(nèi)外對(duì)川續(xù)斷研究主要集中于化學(xué)成分提取測定及對(duì)骨代謝的影響等方面,對(duì)川續(xù)斷在免疫方向的研究報(bào)道相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)選取川續(xù)斷水煎劑灌胃小鼠,觀察其血清中IgA、IgG、IgM、細(xì)胞因子 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 和 TNF-α 含量的變化,探究川續(xù)斷增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能的機(jī)制,并為研發(fā)以川續(xù)斷為基礎(chǔ)的新型中草藥免疫增強(qiáng)劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 中藥川續(xù)斷,購自重慶泰爾森制藥有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小鼠,雌雄各半,體重18～23 g,委托西南大學(xué)榮昌校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)統(tǒng)一訂購。

1.3 檢測試劑盒 小鼠血清 IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 和 TNF-α 檢測試劑盒,購自南京建成生物工程有限公司。

1.4 方法

1.4.1 川續(xù)斷水煎劑的制備 準(zhǔn)確稱取川續(xù)斷飲片200 g,用1 000 mL蒸餾水浸泡1 h后,先文火煎煮1 h,過濾后同樣方法二次煎煮。將兩次藥液合并后,減壓濃縮至相當(dāng)于生藥量2 g/mL的藥液,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取昆明系清潔級(jí)小鼠40只,雌雄各半,體重18～22 g,隨機(jī)分為5組,每組8只,禁食12 h后,分別按10 g/kg·bw(組A)、20 g/kg·bw(組 B)、30 g/kg·bw(組 C)、40 g/kg·bw(組D)灌以終濃度為2 g/mL的川續(xù)斷水煎劑和生理鹽水(對(duì)照組),連續(xù)給藥7 d,給藥劑量見表1。

表1 試驗(yàn)分組及給藥

1.4.3 小鼠血清中免疫球蛋白及細(xì)胞因子的檢測 于末次給藥后7 d,對(duì)小鼠摘除眼球取血,分離血清,于-20℃保存?zhèn)溆?測定各組試驗(yàn)小鼠血清中 IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 和 TNF-α含量,具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠血清中IgA的影響 從圖1中可知,與對(duì)照組相比,川續(xù)斷水煎劑灌胃后均可提高試驗(yàn)小鼠血清中IgA水平(P＜0.05或P＜0.01),其中以10 g/kg·bw劑量效果最佳。

圖1 血清中IgA濃度(μg/mL)的變化

2.2 對(duì)小鼠血清中IgG的影響 從圖2中可知,20、30、40 g/kg·bw川續(xù)斷水煎劑灌胃后均能不同程度地升高血清中IgG的水平(P＜0.05或P＜0.01),其中以20 g/kg·bw劑量效果最佳。

2.3 對(duì)小鼠血清中IgM的影響 從圖3中可知,與空白對(duì)照組相比,不同劑量的川續(xù)斷水煎劑灌胃后均能顯著升高血清中IgM水平(P＜0.05),但各劑量組間差異不顯著。

2.4 對(duì)小鼠血清中IL-2水平的影響 從圖4中可知,與空白對(duì)照組相比,不同劑量的川續(xù)斷水煎劑灌胃后均能顯著升高血清中IL-2水平(P＜0.05),但各劑量組間差異不顯著。

圖2 血清中IgG濃度(mg/mL)的變化

圖3 血清中IgM濃度(μg/mL)的變化

圖4 血清中IL-2濃度(ng/L)的變化

2.5 對(duì)小鼠血清中IL-4水平的影響 從圖5中可知,與空白對(duì)照組相比,不同劑量的川續(xù)斷水煎劑灌胃后均能顯著降低血清中IL-4水平(P＜0.05),但各劑量組間差異不顯著。

2.6 對(duì)小鼠血清中IL-10水平的影響 與對(duì)照組相比,不同劑量的川續(xù)斷水煎劑灌胃后均能顯著降低血清中IL-10水平(P＜0.05),以20 g/kg·bw劑量組最明顯,但各劑量組間差異不顯著,見圖6。

圖5 血清中IL-4濃度(pg/mL)的變化

圖6 血清中IL-10濃度(pg/mL)的變化

2.7 對(duì)小鼠血清中IFN-γ水平的影響 從圖7中可知,與空白對(duì)照組相比,不同劑量的川續(xù)斷水煎劑灌胃后均能顯著升高血清中IFN-γ水平(P＜0.05),但各劑量組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異不顯著。

圖7 血清中IFN-γ濃度(pg/mL)的變化

2.8 川續(xù)斷水煎劑對(duì)小鼠血清TNF-α水平的影響

從圖8中可知,與空白對(duì)照組相比,不同劑量的川續(xù)斷水煎劑灌胃后均能顯著升高血清中TNF-α水平(P＜0.05),但各劑量組之間差異不顯著。

圖8 血清中TNF-α濃度(ng/L)的變化

3 討論

免疫球蛋白是一組由B細(xì)胞受到抗原刺激后增殖分化成的漿細(xì)胞產(chǎn)生,具有抗體活性的蛋白質(zhì),依據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和抗原性差異可分為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五類[7]。IgA分為血清型和分泌型兩種,可介導(dǎo)調(diào)理吞噬作用、發(fā)揮抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(ADCC),同時(shí)也是機(jī)體黏膜免疫防御系統(tǒng)的重要成分,是防止病原體入侵機(jī)體的第一道“屏障”[8]。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白,是機(jī)體抗感染免疫的主力,能夠中和細(xì)菌毒素的毒性,促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用,與病毒結(jié)合后使其失去感染宿主細(xì)胞的能力。IgM是抗原刺激誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫應(yīng)答中最先產(chǎn)生的免疫球蛋白,具有抗菌、抗病毒、中和毒素等生物免疫活性,在機(jī)體抗感染免疫早起發(fā)揮著重要作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),川續(xù)斷水煎劑能提高小鼠血清中IgA、IgG和IgM的含量。提示川續(xù)斷可通過提高血清中免疫球蛋白水平,從來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng),增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。

在細(xì)胞免疫中,T淋巴細(xì)胞處于中心地位[9]。Th細(xì)胞前體(Th cell Precursor)可在抗原的刺激下,分化為中間階段的Th0細(xì)胞,進(jìn)而選擇性分化為Thl或Th2細(xì)胞[10]。Thl淋巴細(xì)胞用于誘導(dǎo)細(xì)胞免疫,分泌的細(xì)胞因子主要有 IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-α等；Th2細(xì)胞主要功能是刺激B淋巴細(xì)胞增殖參與機(jī)體的體液免疫,分泌的細(xì)胞因子主要有IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等。Th1細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子對(duì)Th2細(xì)胞的增殖活化存在抑制作用,反之,Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-10也可抑制Thl細(xì)胞的增殖活化,這兩種細(xì)胞在免疫反應(yīng)中發(fā)揮的作用是相互排斥的。IL-4由分化的TH2細(xì)胞產(chǎn)生,也是其極化的關(guān)鍵指導(dǎo)性信號(hào)。事實(shí)上,驅(qū)動(dòng)和維持TH2細(xì)胞分化所涉及的許多途徑取決于IL-4的誘導(dǎo)[11]。有研究已經(jīng)證實(shí),IL-12可促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化[12],誘導(dǎo)Th1類細(xì)胞合成IFN-成,而IL-10是IL-12的主要生理性抑制劑,在Th1類細(xì)胞分化中負(fù)向調(diào)節(jié)作用[13]。在Th1處于的優(yōu)勢狀態(tài),IL-10受到抑制。本試驗(yàn)結(jié)果表明,川續(xù)斷水煎液在10～40 g/kg濃度范圍內(nèi)能顯著升高小鼠血清TNF-α的水平(P＜0.05),與李賢讓[14]在續(xù)斷總皂苷在治療骨關(guān)節(jié)炎模型的作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組關(guān)節(jié)滑液中TNF-α表達(dá)量明顯升高(P＜0.01)的結(jié)論相一致。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)川續(xù)斷水煎劑在10～40 g/kg濃度范圍內(nèi),能顯著提高血清中Th1類細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ水平,顯著抑制Th2類細(xì)胞因子IL-4和IL-10的分泌,使機(jī)體細(xì)胞免疫以Th1類細(xì)胞處于優(yōu)勢應(yīng)答狀態(tài),增強(qiáng)了機(jī)體非特異性細(xì)胞免疫功能,這與詹光杰[15]等報(bào)道,五鶴續(xù)斷能夠提高衰老小鼠IL-2表達(dá)水平,促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖,從而提高衰老機(jī)體的免疫力的結(jié)果相符。這可能是由于增強(qiáng)了T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化功能,并使Th0淋巴細(xì)胞更多地向Th1細(xì)胞分化,而不是向Th2分化。而對(duì)于川續(xù)斷水煎劑是如何誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞Th1細(xì)胞分化的有關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,有待進(jìn)一步研究。