田婧，蒙秋華，董敏

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧530021)

肝癌(HCC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率逐年升高[1]。雖然HCC的早期診斷和治療取得了重大進(jìn)展，但總體治療效果仍不理想[1，2]。蛋白酪氨酸磷酸酶D(PTPRD)基因是蛋白酪氨酸家族(PTPs)的重要成員[3，4]。PTPs可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、免疫應(yīng)答和重要的細(xì)胞信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。越來(lái)越多的研究表明，PTPRD基因可作為一種抑癌基因，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5～7]。有文獻(xiàn)報(bào)道[8]，PTPRD基因在肝癌細(xì)胞中表達(dá)缺失或失活，PTPRD基因高表達(dá)可明顯抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，但具體機(jī)制尚不明確。近年來(lái)有研究表明，肝癌的發(fā)生發(fā)展涉及多種信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)異常[9，10]，如磷脂酰肌醇3(PI3K)-蛋白激酶B(PKB/Akt)-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路。但關(guān)于PTPRD基因是否可以調(diào)控PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。2017年12月～2018年8月，本研究觀察了上調(diào)PTPRD基因表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移的影響，并基于PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化探索相關(guān)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 正常肝細(xì)胞LO2購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司，肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)于上海美軒公司，肝癌細(xì)胞株HuH-7購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。胎牛血清購(gòu)于以色列BI公司。四甲基偶氮唑鹽試劑購(gòu)北京索萊寶公司。PTPRD過(guò)表達(dá)和陰性對(duì)照腺病毒購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。PTPRD和GAPDH引物序列購(gòu)于上海英濰捷基公司。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)于日本TaKaRa公司。PTPRD、mTOR、p-mTOR、GAPDH抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。Akt和p-Akt抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology試劑公司。BSA粉末購(gòu)于上海碧云天公司。ECL顯影液購(gòu)于美國(guó)Millipore公司。

1.2 LO2、HepG2、HuH-7細(xì)胞中PTPRD mRNA及蛋白表達(dá)觀察

1.2.1 PTPRD mRNA檢測(cè) 采用過(guò)柱法提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行PCR反應(yīng)。PTPRD上游引物序列為5′-TTTACACGAACACCCGTTGA-3′，下游引物序列為5′-CGGAGTCCGTAAGGGTTGTA-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3′，下游引物序列為5′-TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μL。以2-ΔΔCt表示PTPRD mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 PTPRD蛋白檢測(cè) RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。分別取各組適量總蛋白加入4×上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱8 min；配置8%分離膠+5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜；用含5% BSA的TBST溶液室溫?fù)u床封閉PVDF膜1 h，TBST洗滌3次，每次5 min；將PVDF膜分別放入一抗稀釋液中，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；從孵育盒中取出PVDF膜，TBST洗滌3次，每次5 min;放入二抗中室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min；ECL顯影，用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 上調(diào)PTPRD基因表達(dá)對(duì)HuH-7細(xì)胞增殖、遷移的影響觀察

1.3.1 PTPRD基因表達(dá)上調(diào)的HuH-7細(xì)胞構(gòu)建 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HuH-7細(xì)胞消化，以3×105/孔接種于6孔板中，將細(xì)胞分為PTPRD上調(diào)組和陰性對(duì)照組，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培育24 h。根據(jù)腺病毒轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染PTPRD過(guò)表達(dá)腺病毒和陰性對(duì)照腺病毒，轉(zhuǎn)染10 h后更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，使用熒光顯微鏡觀察各組熒光表達(dá)情況并拍照，各組轉(zhuǎn)染效率>95%。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)兩組細(xì)胞中的PTPRD mRNA，采用Western blotting法檢測(cè)PTPRD蛋白。PTPRD上調(diào)組和陰性對(duì)照組PTPRD mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為 8.94±0.13和1，PTPRD蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.48±0.02、1.30±0.03，PTPRD上調(diào)組PTPRD mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于陰性對(duì)照組(P均<0.01)。PTPRD過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

1.3.2 HuH-7細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 兩組細(xì)胞消化后分別以5×103/孔接種于96孔板中，24 h后更換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)同步生長(zhǎng)，分別于0、24、48、72 h后避光，在每孔中加入20 μL的MTT試劑，繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL的DMSO溶液，在37 ℃搖床上混勻15 min，檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值，以PTPRD上調(diào)組與陰性對(duì)照組OD值的比值表示細(xì)胞增殖能力。

1.3.3 HuH-7細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后，將PTPRD過(guò)表達(dá)組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞分別消化，以1×105/孔接種于48孔板中，24 h后細(xì)胞貼壁，吸出原有培養(yǎng)基，用200 μL的槍頭垂直于孔板底部劃“1”，用PBS沖洗細(xì)胞碎片2次后加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并分別于劃痕0、48 h后用顯微鏡觀察、拍照記錄各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移情況。細(xì)胞遷移率=(劃痕后0 h的劃痕面積-劃痕后48 h的劃痕面積)/劃痕后0 h的劃痕面積。

1.4 HuH-7細(xì)胞中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)兩組細(xì)胞中的Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白，方法參照“1.2.2”。

2 結(jié)果

2.1 LO2、HepG2、HuH-7細(xì)胞中PTPRD mRNA及蛋白表達(dá)比較 LO2、HepG2、HuH-7細(xì)胞中PTPRD mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1、0.002±0.001、0.000 069 4±0.000 012 3，PTPRD蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.73±0.15、0.80±0.12、0.70±0.06，HepG2細(xì)胞、HuH-7細(xì)胞中PTPRD mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于LO2細(xì)胞(P均<0.05)。選取PTPRD mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量最低的HuH-7細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 兩組HuH-7細(xì)胞增殖能力比較 PTPRD上調(diào)組細(xì)胞貼壁0、24、48、72 h時(shí)細(xì)胞增殖能力分別為0.17 ±0.01、0.28±0.01、0.58±0.02、0.86±0.02，陰性對(duì)照組分別為0.19±0.01、0.38±0.03、0.82±0.01、1.30±0.04，PTPRD上調(diào)組細(xì)胞貼壁24、48、72 h時(shí)細(xì)胞增殖能力低于陰性對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：與PTPRD上調(diào)組相比，*P<0.05。

2.3 兩組HuH-7細(xì)胞遷移率比較 劃痕48 h后， PTPRD上調(diào)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞遷移率分別為0.09±0.01、0.23±0.01，PTPRD上調(diào)組細(xì)胞遷移率低于陰性對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 兩組HuH-7細(xì)胞劃痕后0、48 h細(xì)胞遷移情況

2.4 兩組HuH-7細(xì)胞中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)比較 PTPRD組上調(diào)組細(xì)胞中Akt、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.04、0.96±0.02，p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR分別為0.65±0.02、0.72± 0.03；陰性對(duì)照組分別為1.22±0.12、1.11±0.08、1.02±0.01、1.32±0.09。PTPRD上調(diào)組細(xì)胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR均低于陰性對(duì)照組(P均<0.01)。

3 討論

肝癌惡性程度高、預(yù)后極差。雖然近年來(lái)肝癌的相關(guān)基礎(chǔ)研究和臨床研究取得了巨大進(jìn)展，但由于肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不明確，肝癌的預(yù)防、診斷和治療仍面臨重重阻礙。此外，由于肝癌的惡性程度高、侵襲性極強(qiáng)及治療后復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率高，導(dǎo)致患者的總體預(yù)后普遍較差，5年生存率不足10%[11，12]。因此，進(jìn)一步闡明肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的基因治療靶點(diǎn)，對(duì)肝癌的預(yù)防、早期診斷、治療水平的提高、改善患者生存質(zhì)量等方面具有重要意義。

PTPRD基因位于9p23-p24.3，其基因編碼的蛋白包含1 912個(gè)氨基酸，在正常腦、肝臟、胰臟、脂肪組織等組織中高表達(dá)[3，4]。隨著對(duì)PTPRD基因的研究不斷深入，越來(lái)越多的研究顯示，PTPRD基因在肝癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肺癌和黑色素瘤等多種惡性腫瘤中均存在表達(dá)缺失或表觀遺傳學(xué)變化，并且誘導(dǎo)PTPRD基因過(guò)表達(dá)后可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[5～8]。以上研究結(jié)果提示，PTPRD基因與肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有關(guān)，但其機(jī)制尚不清楚。我們通過(guò)初步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PTPRD mRNA及蛋白在人正常肝細(xì)胞株LO2和肝癌細(xì)胞株HepG2、HuH-7中的表達(dá)水平有顯著性差異，且HuH-7細(xì)胞中PTPRD表達(dá)低于HepG2細(xì)胞，提示PTPRD表達(dá)缺失可能與肝癌的發(fā)病有關(guān)。對(duì)不同肝癌細(xì)胞系同一基因表達(dá)的差異進(jìn)行深入研究，可能會(huì)對(duì)不同病因所引起的肝癌的治療和預(yù)后評(píng)估有重要指導(dǎo)意義。我們成功構(gòu)建了PTPRD基因過(guò)表達(dá)的HuH-7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PTPRD基因過(guò)表達(dá)后可明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。以上研究結(jié)果均表明，PTPRD基因在人肝癌細(xì)胞中低表達(dá)，可作為一種抑癌基因參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

研究表明PTPs家族成員在細(xì)胞內(nèi)均具有兩個(gè)磷酸酶活性的結(jié)構(gòu)域D1和D2，可以與酪氨酸激酶共同調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸磷酸化和去磷酸化過(guò)程，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[4]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，一些PTPs家族成員可負(fù)性調(diào)控PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，如蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP-1)[13]、磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)等[14]。PI3k-Akt-mTOR信號(hào)通路是體內(nèi)一條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[15，16]。研究[16～19]發(fā)現(xiàn)，該信號(hào)通路在肝癌、胃癌、乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤細(xì)胞中均存在功能異常，與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡有關(guān)。PTPRD基因作為PTPs家族的重要成員之一，其能否調(diào)控PI3k-Akt-mTOR信號(hào)通路，影響肝癌細(xì)胞的增殖與遷移尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究檢測(cè)了兩組HuH-7細(xì)胞中PI3k-Akt-mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白Akt、p-Akt、TOR、p-mTOR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTPRD基因過(guò)表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞中p-Akt、p-mTOR蛋白的表達(dá)水平，抑制PI3k-Akt-mTOR信號(hào)通路激活，提示PTPRD基因可能參與負(fù)性調(diào)控PI3k-Akt-mTOR信號(hào)通路，抑制肝癌細(xì)胞的增殖與遷移。

綜上所述，PTPRD可能通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，其有望作為潛在的肝癌治療靶點(diǎn)。但由于現(xiàn)階段相關(guān)研究較少，且體內(nèi)的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)錯(cuò)綜復(fù)雜，僅憑細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)研究無(wú)法全面闡述PTPRD表達(dá)上調(diào)后對(duì)肝癌細(xì)胞的作用效應(yīng)。因此，今后可以從表觀遺傳學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)等方面展開(kāi)更深入的研究和探討，為肝癌的治療提供新思路。