胡博森，周波，張卓，王曉紅，陳擁

(1沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，沈陽110034；2沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院)

骨質(zhì)疏松癥及其導(dǎo)致的骨折是影響老年人生活質(zhì)量的主要慢性疾病之一。骨質(zhì)疏松癥成因與骨組織中的成骨細(xì)胞成骨能力下降有關(guān)。據(jù)報(bào)道屬于花色苷類的矢車菊素-3-葡萄糖苷(C3G)有預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的作用，其潛在的作用機(jī)制包括抑制破骨細(xì)胞功能及促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[1]。目前研究多集中在C3G對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用，而關(guān)于其對(duì)成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的研究較少。研究[2]表明，C3G可抑制某些細(xì)胞的遷移能力。如C3G聯(lián)合阿托伐他汀可拮抗血管內(nèi)皮緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移；肝臟纖維化模型中，C3G對(duì)肝星狀細(xì)胞遷移具有抑制作用[3]。另外，C3G還能抑制乙醇誘導(dǎo)的過表達(dá)ErbB2型乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[4]。成骨細(xì)胞遷移對(duì)骨形成和骨折愈合具有重要作用[5]，但C3G對(duì)成骨細(xì)胞遷移能力的影響未見報(bào)道。骨質(zhì)疏松性骨折好發(fā)于髖部，使用人髖部松質(zhì)骨來源的原代成骨細(xì)胞模型對(duì)花色苷類物質(zhì)抗骨質(zhì)疏松癥研究具有重要意義。2017年5月～2018年4月，本研究擬取髖部骨來源的人原代成骨細(xì)胞，觀察C3G對(duì)成骨細(xì)胞遷移能力的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 C3G購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)M86905。改良型最低必需培養(yǎng)基(α-MEM)、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司。紅細(xì)胞裂解液(碳酸氫鈉840 mg、乙二胺四乙酸37.2 mg、氯化銨8.023 g、雙蒸水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.2)、酶消化液(膠原酶5 g/L、透明質(zhì)酸酶2.5 g/L)均購自上海生工生物工程股份有限公司。瑞氏-姬姆薩染色試劑盒、茜素紅染色試劑盒購自南京凱基公司。TRIzol試劑、mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。CO2培養(yǎng)箱(BB-15，美國賽默飛世爾)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7500FAST，美國ABI)、超凈工作臺(tái)(HD-1360，北京東聯(lián)哈爾)、倒置顯微鏡(CKX31，日本奧林巴斯)。

1.2 人成骨細(xì)胞的獲取及分組 實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)沈陽醫(yī)學(xué)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，被取材患者均簽屬知情同意書。標(biāo)本取自股骨頭置換術(shù)患者，剪取松質(zhì)骨組織，使用膠原酶消化法提取原代成骨細(xì)胞。在含有10% FBS的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37 ℃、5% CO2、飽和濕度。細(xì)胞生長(zhǎng)接近融合時(shí)按1∶2傳代。培養(yǎng)14 d時(shí)加入含有10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉和50 mg/L的抗壞血酸的完全培養(yǎng)液以誘導(dǎo)礦化。誘導(dǎo)結(jié)束后用乙醇固定細(xì)胞，進(jìn)行瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色和茜素紅染色并拍照保存。茜素紅染色以鏡下見紅染結(jié)構(gòu)為陽性。瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色結(jié)果顯示原代成骨細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形、多角形或多樹突狀，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞內(nèi)單核；高倍鏡下可觀察到細(xì)胞呈層疊生長(zhǎng)趨勢(shì)，低倍鏡下細(xì)胞呈“渦輪”狀生長(zhǎng)；經(jīng)誘導(dǎo)礦化后，細(xì)胞聚集處可觀察到大小不一的紅染結(jié)構(gòu)，即成骨細(xì)胞鈣化點(diǎn)。繼續(xù)培養(yǎng)至28 d，將獲得的成骨細(xì)胞分為C3G組和對(duì)照組。

1.3 細(xì)胞遷移能力觀察 采用劃痕實(shí)驗(yàn)。將成骨細(xì)胞以5×105/皿接種至直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，24 h后更換為無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)基，使用1 000 μL槍頭在培養(yǎng)皿表面劃線。劃痕后將C3G組培養(yǎng)基更換為含100 μmol/L的C3G的無血清α-MEM培養(yǎng)基；對(duì)照組培養(yǎng)基中不含C3G，其余培養(yǎng)條件與C3G組相同。分別于劃痕后0、6、24、54 h在倒置顯微鏡下選取寬度適宜、劃痕兩側(cè)均勻、視野良好的區(qū)域進(jìn)行拍照，照片通過后期裁剪和調(diào)整保證相對(duì)位置一致。以劃痕兩側(cè)細(xì)胞經(jīng)移動(dòng)后相互接觸所需時(shí)間評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。

1.4 細(xì)胞中骨橋蛋白(OPN)mRNA檢測(cè) 將成骨細(xì)胞以1.5×106/皿接種至直徑100 mm的培養(yǎng)皿中，24 h后更換為無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)基。將C3G組培養(yǎng)基更換為含100 μmol/L的C3G的α-MEM完全培養(yǎng)基；對(duì)照組培養(yǎng)基中不含C3G，其余條件與C3G組相同。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后提取總mRNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)成骨細(xì)胞中的OPN mRNA，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。目的基因引物及內(nèi)參GADPH引物的設(shè)計(jì)和合成均由上海生工生物工程股份有限公司完成。OPN基因上游引物序列為5′-CCACAGCCACAAGCAGTCCAG-3′，下游引物序列為5′-TCCTGACTATCAATCACATCGGAATGC-3′。擴(kuò)增條件為95 ℃ 30 s，(95 ℃ 3 s變性，60 ℃ 30 s退火/延伸)×40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示OPN mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞劃痕后愈合能力比較 如圖1所示，劃痕后6 h，對(duì)照組劃痕邊緣細(xì)胞開始移動(dòng)，而C3G組無此現(xiàn)象，僅可見因劃痕而破碎的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生略微改變；劃痕后24 h，對(duì)照組細(xì)胞有向劃痕區(qū)域遷移的明顯趨勢(shì)，C3G組細(xì)胞僅發(fā)生輕微移動(dòng)；劃痕后54 h，對(duì)照組劃痕兩側(cè)細(xì)胞接觸，劃痕已無法明確分辨，C3G組細(xì)胞則剛剛呈現(xiàn)遷移趨勢(shì)，截至本次觀察終點(diǎn)C3G組細(xì)胞劃痕未能愈合。

2.2 兩組細(xì)胞中OPN mRNA表達(dá)比較 對(duì)照組、C3G組細(xì)胞中OPN mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.04±0.28、0.26±0.22，C3G組細(xì)胞中OPN mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.05)。

注：a、b、c、d分別為對(duì)照組劃痕后0、6、24、54 h細(xì)胞遷移情況；e、f、g、h分別為C3G組劃痕后0、6、24、54 h細(xì)胞遷移情況。

3 討論

花色苷是一類天然植物色素，具有抗炎抗氧化和抗骨質(zhì)疏松活性[6]。C3G是一種常見的花色苷[7]。據(jù)報(bào)道，C3G具有抗骨質(zhì)疏松活性，可抑制破骨細(xì)胞成熟并促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，但機(jī)制尚未明確[8～10]。在成骨細(xì)胞行使骨質(zhì)合成功能的過程中，細(xì)胞遷移至關(guān)重要。骨形態(tài)發(fā)生早期前成骨細(xì)胞受多種趨化因子調(diào)節(jié)從而向特定區(qū)域遷移并啟動(dòng)分化進(jìn)程；骨折修復(fù)的起始階段即成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞向骨折部位遷移；骨形態(tài)發(fā)生的中晚期成骨細(xì)胞經(jīng)由被動(dòng)捕獲機(jī)制向成熟的骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變，包括成骨細(xì)胞合成類骨質(zhì)并自埋或被相鄰細(xì)胞嵌入，遷移能力下降、完成骨鹽沉積等[11]。現(xiàn)已證實(shí)，花色苷類物質(zhì)可在體內(nèi)外抑制某些細(xì)胞遷移。例如：葡萄花色苷可拮抗組織蛋白酶L介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲[12]；口服黑米花色苷可抑制荷瘤BALB/c裸鼠體內(nèi)接種的ErbB2陽性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-453的轉(zhuǎn)移[13]；在非腫瘤細(xì)胞模型中，C3G可通過抑制肝星狀細(xì)胞遷移從而抗肝臟纖維化[3]。

本研究使用人原代成骨細(xì)胞，研究采取的原代細(xì)胞提取方案能夠成功提取原代成骨細(xì)胞樣本。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是觀察細(xì)胞遷移能力的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。本研究結(jié)果顯示，劃痕后3、6、24、54 h，對(duì)照組細(xì)胞不斷向劃痕處遷移，C3G組遷移速度明顯減慢，劃痕愈合時(shí)間延長(zhǎng)，提示C3G可抑制成骨細(xì)胞的遷移。C3G分子的黃酮骨架上結(jié)合了多個(gè)酚羥基，酚羥基數(shù)目是花色苷類物質(zhì)抗氧化能力和穩(wěn)定性的重要影響因素。C3G的抗氧化能力最強(qiáng)但穩(wěn)定性較差[14]，因此在劃痕后54 h時(shí)C3G組細(xì)胞遷移能力開始恢復(fù)的原因可能與培養(yǎng)基中有效的C3G成分減少有關(guān)。

OPN是成骨細(xì)胞分化早期的重要蛋白，是一種多功能的基質(zhì)細(xì)胞蛋白，被認(rèn)為在傷口愈合和細(xì)胞對(duì)機(jī)械應(yīng)力的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。OPN具有趨化成骨細(xì)胞向骨折等部位遷移的能力，是誘導(dǎo)機(jī)械應(yīng)力引起的骨重建的重要因素。OPN參與成骨細(xì)胞的移動(dòng)過程，在間充質(zhì)細(xì)胞分化早期表達(dá)。研究顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞啟動(dòng)成骨分化進(jìn)程的早期，OPN表達(dá)量提高10倍以上，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的遷移活動(dòng)。OPN除在骨組織中發(fā)揮重要作用外，還與多種細(xì)胞的遷移活動(dòng)有關(guān)。OPN在肺纖維化發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。在某些腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)遷移和侵襲模型中亦可觀察到OPN高表達(dá)現(xiàn)象[15,16]。有學(xué)者[17]指出，OPN不僅能促進(jìn)成骨細(xì)胞的遷移，還是單核細(xì)胞遷移的重要趨化因子，這意味著OPN具有潛在的調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的作用。骨折愈合過程中，OPN蛋白可能是誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的重要趨化因子，在缺氧骨細(xì)胞模型中使用OPN抗體可拮抗細(xì)胞的遷移作用[18]。本研究中，C3G組細(xì)胞中OPN mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，我們推測(cè)C3G可能通過下調(diào)OPN基因表達(dá)從而抑制成骨細(xì)胞的遷移能力。OPN表達(dá)下降對(duì)成骨細(xì)胞成熟具有積極意義，但在骨折愈合早期OPN表達(dá)水平下降可能會(huì)影響骨折愈合進(jìn)程的啟動(dòng)。此外，人群研究報(bào)告指出糖尿病患者血清高水平的OPN與低骨密度及高骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[19]。盡管尚不能確定OPN蛋白表達(dá)和骨折風(fēng)險(xiǎn)之間的因果關(guān)系，但本研究結(jié)果為C3G抗骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制研究提供了新的思路。Liu等[20]報(bào)道OPN促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲依賴促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K途徑)；Pantan等[2]也發(fā)現(xiàn)，C3G在人血管平滑肌細(xì)胞模型中抑制細(xì)胞遷移能力同樣依賴MAPK和PI3K途徑。本研究中，C3G抑制成骨細(xì)胞遷移及抑制OPN表達(dá)的作用是否與MAPK、PI3K途徑有關(guān)，仍有待后續(xù)研究驗(yàn)證。