李建祺，張晶，甄亞男，魏飛力，歐陽雅博，肖瑞雪，徐忠法

(1濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250022；2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院；3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 北京市肝病研究所)

現(xiàn)階段對結(jié)直腸癌的篩查多依靠糖類抗原檢測，其特異性較理想，但敏感性較低，早期診斷率較低，因此需要尋找一種更加有效的篩查及評價(jià)方法。環(huán)狀RNA(circRNA)是一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼RNA(ncRNA)[1]。circRNA存在數(shù)量眾多，作用機(jī)制豐富，影響范圍廣泛，在結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌、肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮重要作用[2，3]，因此可能成為反映結(jié)直腸癌發(fā)生、進(jìn)展的新的生物標(biāo)志物。2016年5月～2018年10月，本研究對不同分期結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)癌旁組織的circRNA表達(dá)進(jìn)行比較，篩選差異性表達(dá)的circRNA，并分析其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本來源及分組 結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織來源于2016～2018年在山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院行結(jié)直腸癌根治手術(shù)且經(jīng)病理證實(shí)的9例原發(fā)性結(jié)直腸癌患者，男5例、女4例，年齡54～64(59±6)歲，直腸癌8例、乙狀結(jié)腸癌1例，病理分型均為腺癌?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：病理診斷為原發(fā)性結(jié)直腸腺癌；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受過化療、放療、免疫治療；同時(shí)合并其他類型的惡性腫瘤；臨床資料不完整。根據(jù)TNM分期將組織標(biāo)本分為A(T1～3N0M0)、B(T4a～bN0M0)、C(T4a～bN1～2M0)組。入組患者均簽署相關(guān)知情文件，同時(shí)本研究已得到山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 樣本RNA的提取及質(zhì)控 獲取結(jié)直腸癌組織標(biāo)本后立即剪成直徑<0.5 cm的小塊，浸沒在5倍體積的RNAlater中，4 ℃浸泡過夜，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。利用定容RNA的RNAse-free Water作為空白對照，每個(gè)樣品吸取1 μL，用分光光度計(jì)測定RNA溶液在260 nm、280 nm波長處的吸光度值，檢測RNA的濃度和純度。每個(gè)樣品吸取400～700 ng的總RNA，用1.5%甲醛變性凝膠電泳(120 V)15 min，在凝膠成像儀下檢測總RNA中28 S和18 S的完整性。

1.3 結(jié)直腸癌組織中差異表達(dá)circRNA的篩選 各組RNA樣品依次進(jìn)行添加多聚腺苷酸、標(biāo)記、雜交、洗脫、掃描等操作，后用Affymetrix Scanner3000 7G激光共聚焦掃描儀對雜交后的Affymetrix Clariom D芯片進(jìn)行掃描。最后對雜交信號(hào)值進(jìn)行本底分離及標(biāo)準(zhǔn)化操作。以調(diào)整后P<0.05、|log2FC|>2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)circRNA在每個(gè)樣本中的表達(dá)值進(jìn)行聚類分析，采用Cluster3.0軟件制作聚類圖。按照TNM分期逐漸增高的順序設(shè)計(jì)序列實(shí)驗(yàn)，篩選出隨TNM分期表達(dá)變化最顯著、最主流的基因群，對差異circRNA進(jìn)行表達(dá)趨勢分析。將呈主流表達(dá)趨勢的circRNA作為進(jìn)一步研究的目標(biāo)基因。根據(jù)circRNA與mRNA的實(shí)測值，通過共表達(dá)計(jì)算方式構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，按基因?qū)傩栽u分，得到處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心的circRNA(共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)基因?qū)傩栽u分前10位)，再與目標(biāo)基因群進(jìn)行交集處理，篩選出與結(jié)直腸癌進(jìn)展密切相關(guān)的circRNA。

1.4 差異表達(dá)circRNA對應(yīng)mRNA的功能分析 通過circRNA周邊與其共表達(dá)的mRNA來預(yù)測未知mRNA的功能。對差異表達(dá)基因通過DAVID6.7網(wǎng)站整合的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體論(GO)分析和京都基因與基因組大百科全書(KEGG)信號(hào)通路描述分析，篩選功能最顯著的基因。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中差異表達(dá)circRNA篩選結(jié)果 初步分析發(fā)現(xiàn)，A組癌組織與癌旁組織比較，有424個(gè)差異表達(dá)circRNA，其中表達(dá)降低165個(gè)、表達(dá)升高239個(gè)；B組差異表達(dá)circRNA共計(jì)560個(gè)，表達(dá)降低284個(gè)、表達(dá)升高276個(gè)；C組差異表達(dá)circRNA共計(jì)409個(gè)，表達(dá)降低190個(gè)、表達(dá)升高220個(gè)(P<0.05，F(xiàn)C>1.5)。對各組差異表達(dá)circRNA進(jìn)行聚類分析。之后將A組的差異表達(dá)circRNA在B組、C組中進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)行表達(dá)趨勢分析。對差異表達(dá)circRNA的表達(dá)豐度進(jìn)行多次驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)circRNA表達(dá)隨結(jié)直腸癌的進(jìn)展而降低為主流趨勢。編號(hào)0～15組circRNA群中，僅編號(hào)1、2、6、7、8、9組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)，其中編號(hào)第7組差異表達(dá)circRNA的表達(dá)變化趨勢既符合主流趨勢同時(shí)更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，且值更小)，故選定第7組的差異表達(dá)circRNA為主要研究對象。第7組circRNA共有103條，與共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)基因?qū)傩栽u分前10位的circRNA(表1)進(jìn)行交集處理，篩選出與結(jié)直腸癌進(jìn)展密切相關(guān)的8個(gè)circRNA，分別為hsa_circ_0000007、hsa_circ_0001111、hsa_circ_0006977、hsa_circ_0079656、hsa_circ_0023608、hsa_circ_0024508、hsa_circ_0026694、hsa_circ_0029903。通過預(yù)測篩選出500余個(gè)相關(guān)mRNA，并非均具有重要生物學(xué)作用，因此進(jìn)一步進(jìn)行GO分析和KEGG分析。

圖1 差異表達(dá)circRNA的表達(dá)趨勢圖

表1 共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)基因?qū)傩栽u分前10位的circRNA

2.2 差異表達(dá)circRNA對應(yīng)mRNA的GO分析和KEGG分析結(jié)果 對8個(gè)circRNA相對應(yīng)的所有mRNA進(jìn)行GO功能注釋分析(圖2)及KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，被富集的大部分基因及hsa03010通路(P<0.05)主要參與核糖體RNA的加工與代謝、RNA的剪切與加工處理等細(xì)胞基礎(chǔ)功能過程。在8個(gè)與結(jié)直腸癌進(jìn)展密切相關(guān)的circRNA中，hsa_circ_0079656與HINFP基因存在顯著生物學(xué)功能關(guān)系，HINFP基因可能與細(xì)胞有絲分裂周期G1/S期的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。確定hsa_circ_0079656為最終目標(biāo)基因。

3 討論

circRNA是通過套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化或內(nèi)含子配對驅(qū)動(dòng)環(huán)化形成的環(huán)形RNA，該RNA早在1976年在植物病毒中發(fā)現(xiàn)，但一直認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)品，并不存在生物學(xué)作用。近年來隨著研究水平的不斷提高，大量高精度探針及檢驗(yàn)儀器投入使用，circRNA被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于不同生物的細(xì)胞質(zhì)中，具有高度穩(wěn)定的特性[4]，在真核生物細(xì)胞中發(fā)揮重要作用[5]。

研究發(fā)現(xiàn)，circRNA與糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化及心力衰竭、心肌梗死等多種疾病進(jìn)展均有一定的相關(guān)性[6,7]。胃癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，circRNA利用miRNA應(yīng)答元件結(jié)合相應(yīng)miRNA，阻止miRNA抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響惡性腫瘤的進(jìn)展[8～12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，與相鄰的正常組織相比，多種惡性腫瘤組織中存在異常表達(dá)的circRNA。Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0091579在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著升高，可能作為肝癌診斷及預(yù)后評估的標(biāo)志物。Chi等[14]發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0000285在膀胱癌組織中的表達(dá)水平顯著降低，可能作為膀胱癌的診斷及預(yù)后評估標(biāo)志物。Chen等[15]研究表明，hsa_circ_0000190診斷胃癌具有更好的敏感性和特異性。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌組織中circRNA表達(dá)水平隨腫瘤進(jìn)展而降低，說明circRNA有可能成為結(jié)直腸癌的新型生物標(biāo)志物。

圖2 差異表達(dá)circRNA相對應(yīng)mRNA的GO分析結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)，各組circRNA的表達(dá)存在不同程度變化。之后按照結(jié)直腸癌TNM分期順序設(shè)計(jì)序列實(shí)驗(yàn)，篩選出隨TNM分期變化最顯著、最主流的基因群，對樣本的差異表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)趨勢分析。選取表達(dá)變化與結(jié)直腸癌進(jìn)展程度具有顯著聯(lián)系的基因，結(jié)合主流表達(dá)趨勢，篩選出進(jìn)一步研究的目標(biāo)基因。本研究中差異表達(dá)circRNA的主流變化趨勢為隨病情進(jìn)展而表達(dá)降低，有學(xué)者在肝癌及結(jié)直腸癌相關(guān)研究中也有類似發(fā)現(xiàn)[15，16]。

借助共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)可發(fā)現(xiàn)circRNA與mRNA之間可能存在的作用關(guān)系，找到影響mRNA表達(dá)的circRNA，從而發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中起中心調(diào)控作用的circRNA及可能存在的新作用機(jī)制。我們依據(jù)基于芯片的實(shí)測值運(yùn)算，突破了傳統(tǒng)分析中基因注釋不齊全的限制，增加了研究的創(chuàng)新性。本研究發(fā)現(xiàn)，在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中存在500余個(gè)circRNA位于共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)核心位置，篩選其中評分前10位者，與第7組差異circRNA群進(jìn)行交集，得到8個(gè)與結(jié)直腸癌進(jìn)展密切相關(guān)的circRNA，即hsa_circ_0000007、hsa_circ_0001111、hsa_circ_0006977、hsa_circ_0079656、hsa_circ_0023608、hsa_circ_0024508、hsa_circ_0026694、hsa_circ_0029903。

GO數(shù)據(jù)庫是一個(gè)跨物種、綜合性、描述性的數(shù)據(jù)庫，目的在于建立一個(gè)適用于各種物種、對基因和蛋白功能進(jìn)行限定和描述并能隨著研究不斷深入而更新的語義詞匯標(biāo)準(zhǔn)。KEGG可提供整合代謝途徑查詢，包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代謝及有機(jī)物的生物降解，不僅提供了所有可能的代謝途徑，而且對催化各步反應(yīng)的酶進(jìn)行了全面的注解。通路富集分析可將本研究中得到的差異表達(dá)基因基于KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號(hào)通路注釋，得到基因參與的所有信號(hào)通路后，利用Fisher精確檢驗(yàn)和多重比較檢驗(yàn)計(jì)算每個(gè)信號(hào)通路的顯著性水平和誤判率，從而篩選出基因參與的重點(diǎn)信號(hào)通路。我們分別對8個(gè)差異表達(dá)circRNA所預(yù)測的mRNA用GO功能注釋分析及KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)被富集的大部分基因及hsa03010通路主要參與核糖體RNA的加工與代謝、RNA的剪切與加工處理等細(xì)胞基礎(chǔ)功能，其中hsa_circ_0079656與HINFP基因存在顯著生物學(xué)關(guān)系，而HINFP基因主要參與細(xì)胞有絲分裂周期中G1/S期的轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控。

總之，經(jīng)篩選與分析，本研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0079656在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)且隨病情進(jìn)展表達(dá)降低，該circRNA可能通過作用于HINFP基因從而調(diào)控細(xì)胞有絲分裂周期中G1/S期的轉(zhuǎn)錄過程，影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)存在一些不足：由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間限制，未進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證，相關(guān)作用機(jī)制僅為預(yù)測結(jié)果；由于實(shí)驗(yàn)分組需均衡各臨床病理分期組織樣本，導(dǎo)致樣本收集工作存在困難，未能取得充足實(shí)驗(yàn)樣本；本研究僅針對結(jié)直腸癌浸潤深度進(jìn)行研究，未考慮其他分期因素。因此，今后仍需增加后續(xù)實(shí)驗(yàn)，逐步完善其他樣本數(shù)據(jù)，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析驗(yàn)證上述結(jié)果。