朱艷，朱玉廣，曹智，滕興波，孫海霞，劉憲金，楊偉舟

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濰坊261053)

后囊膜混濁(PCO)是現(xiàn)代白內(nèi)障手術(shù)后常見的并發(fā)癥之一，影響患者視功能恢復(fù)，可造成嚴(yán)重的視力損害[1]。白內(nèi)障手術(shù)后殘存的晶狀體上皮細(xì)胞(HLECs)發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是PCO形成的病理基礎(chǔ)[2]。整合素連接激酶(ILK)是一種絲氨酸/蘇氨酸細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶，ILK參與整合素、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)等多條細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，ILK活化后可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、黏附、增殖、分化及血管生成等多種生物學(xué)過程[3～5]。另外，ILK也是一種低氧反應(yīng)因子，在細(xì)胞缺氧時(shí)表達(dá)增高[6,7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ILK參與TGF-β2誘導(dǎo)的HLECs EMT[8]。最近研究表明，缺氧可誘導(dǎo)HLECs發(fā)生EMT[9]。然而，對(duì)于缺氧條件下ILK是否參與HLECs的EMT目前尚不清楚。2018年1～6月，本研究建立HLECs缺氧模型，觀察ILK在缺氧HLECs中的表達(dá)變化及其對(duì)細(xì)胞EMT的影響，從新的視角探索HLECs EMT早期發(fā)生機(jī)制，尋找早期干預(yù)EMT的有效方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 人永生化晶狀體上皮細(xì)胞HLEC-B3(美國ATCC公司)，兔抗人ILK單克隆抗體、兔抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)單克隆抗體(美國Sigma公司)，兔抗人纖維連接蛋白(FN)單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，羊抗兔IgG(美國Abcam公司)，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(美國GIBCO公司)，CoCl2(美國Sigma公司)，TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)，ILK抑制劑QLT0267(加拿大QLT公司)，PCR引物(上海生工公司)。

1.2 HLECs缺氧模型構(gòu)建及ILK檢測(cè) 取液氮保存的HLEC-B3細(xì)胞系，在37 ℃水浴箱中快速解凍，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管，滴加DMEM培養(yǎng)液，吹打混勻后離心，棄上清液，加入含雙抗抗生素的DMEM培養(yǎng)液(20%胎牛血清)，吹打混勻，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中單層貼壁培養(yǎng)。每3～4 d換DMEM培養(yǎng)液1次，胰蛋白酶消化傳代。取處于對(duì)數(shù)生長期的HLECs，胰蛋白酶消化，以10×106/L接種于96孔板，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后去培養(yǎng)液，分別加入0、25、50、100、200、400 μmol/L的CoCl2，每個(gè)CoCl2濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，采用CCK-8法測(cè)算細(xì)胞存活率，最終選擇100 μmol/L的CoCl2進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。在HLECs培養(yǎng)瓶中加入含100 μmol/L CoCl2的DMEM培養(yǎng)液分別培養(yǎng)0、6、12、24、48 h后收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解法提取總蛋白，BCA法測(cè)定樣本蛋白濃度并配平，取變性蛋白20 g/孔加入凝膠加樣孔進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂奶粉封閉；TBST 37 ℃封閉1 h，加入相應(yīng)一抗(兔抗人ILK單克隆抗體,1∶500)4 ℃孵育過夜；次日TBST洗膜，加二抗IgG(1∶1 000)室溫孵育2 h;TBST洗膜，按照ECL試劑盒說明操作，室溫下曝光、顯影并定影；采用UVP凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 ILK表達(dá)變化對(duì)缺氧HLECs中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響觀察

1.3.1 HLECs分組及處理 將HLECs分為CoCl2組、ILK抑制劑組、對(duì)照組。CoCl2組加入含100 μmol/L CoCl2的培養(yǎng)基；ILK抑制劑組用ILK特異性抑制劑QLT0267(10 nmol/L)預(yù)處理1 h后，再加入含100 μmol/L CoCl2的培養(yǎng)基；對(duì)照組加入無血清培養(yǎng)基。三組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 α-SMA、FN蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)三組細(xì)胞中的α-SMA、FN蛋白。具體方法參考“1.2”。

1.3.3 α-SMA、FN mRNA檢測(cè) 收集三組細(xì)胞，TRIzol提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，以人β-actin基因作為內(nèi)參。α-SMA基因上游引物序列為5′-CTGACAGAGGCACCACTGAA-3′，下游引物序列為5′-CATCTCCAGAGTCCAGCACA-3′。FN基因上游引物序列為5′-GAGAATAAGCTGTACCATCGCAA-3′，下游引物序列為GGGCGAGTAGGAGCAGTTG-3′。人β-actin基因上游引物序列為5′-CTTACAGATCATGTTTGAGACCTTCAA-3′，下游引物序列為5′-CTCAGGGCAGCGGAACC-3′。反應(yīng)條件為93 ℃ 3 min；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。測(cè)得目的基因和β-actin基因的循環(huán)閾值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算目的基因與β-actin基因的拷貝數(shù)，以二者比值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 不同缺氧時(shí)間HLECs中ILK蛋白表達(dá)變化 缺氧0、6、12、24、48 h時(shí)HLECs中ILK蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.382±0.018、0.515±0.023、0.807±0.044、0.951±0.048、0.256±0.019。缺氧6、12、24、48 h時(shí)ILK蛋白相對(duì)表達(dá)量均增高，其中缺氧12、24 h時(shí)ILK蛋白相對(duì)表達(dá)量高于缺氧6、48 h時(shí)(P均<0.05)。見圖1。

圖1 缺氧不同時(shí)間HLECs中ILK蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

2.2 各組HLECs中α-SMA、FN蛋白表達(dá)比較 CoCl2組、ILK抑制劑組及對(duì)照組α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.671±0.032、0.428±0.025、0.091±0.014；FN蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.125±0.133、0.420±0.029、0.136±0.012。CoCl2組細(xì)胞中α-SMA、FN蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，ILK抑制劑組細(xì)胞中α-SMA、FN蛋白相對(duì)表達(dá)量低于CoCl2組(P均<0.01)。見圖2。

注：1為CoCl2組；2為ILK抑制劑組；3為對(duì)照組。

2.3 各組HLECs中α-SMA、FN mRNA表達(dá)比較 CoCl2組、ILK抑制劑組及對(duì)照組α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.851±0.038、0.672±0.019、0.053±0.013；FN mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.036±0.042、0.892±0.027、0.157±0.016。CoCl2組細(xì)胞中α-SMA、FN mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，ILK抑制劑組細(xì)胞中α-SMA、FN mRNA相對(duì)表達(dá)量低于CoCl2組(P均<0.01)。

3 討論

白內(nèi)障是我國最常見的致盲性眼病，目前治療白內(nèi)障的手術(shù)方案為超聲乳化術(shù)聯(lián)合后房人工晶體植入[10]。白內(nèi)障術(shù)后PCO影響部分患者視功能的恢復(fù)。對(duì)于高端人工晶體植入術(shù)，PCO是白內(nèi)障術(shù)后視覺干擾的主要因素之一[11,12]。白內(nèi)障手術(shù)過程中保留了晶狀體囊袋，囊內(nèi)殘存的HLECs增生、分化是手術(shù)后PCO發(fā)生的主要原因[2]，HLECs的EMT是PCO形成的主要病理基礎(chǔ)。

ILK是一種與細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞信號(hào)通道有關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶，與細(xì)胞內(nèi)多種活性蛋白關(guān)系密切。ILK參與整合素、HIF-1等多條細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。ILK活化后對(duì)下游的效應(yīng)蛋白進(jìn)行磷酸化從而發(fā)揮效應(yīng)，參與細(xì)胞的生長、分化、遷移和腫瘤生成等過程[3]。同時(shí)，ILK也是一種低氧反應(yīng)性因子，低氧可誘導(dǎo)ILK表達(dá)，激活多條與低氧應(yīng)激等有關(guān)的信號(hào)通路，影響細(xì)胞多種生物學(xué)功能[6]。

不同于人體內(nèi)的其他細(xì)胞，晶狀體及其上皮細(xì)胞存在于缺氧環(huán)境中[13]。建立HLECs缺氧模型可模擬體內(nèi)HLECs的微環(huán)境[9,14]。CoCl2通過其CO2+替代血紅素的Fe2+與氧進(jìn)行結(jié)合，使干預(yù)細(xì)胞處在缺氧狀態(tài)。在常氧狀態(tài)下，CoCl2還可激活細(xì)胞內(nèi)HIF-1α誘導(dǎo)的信號(hào)通路，發(fā)揮類似缺氧的效應(yīng)[15]。因而CoCl2常被用于制備細(xì)胞缺氧模型。本研究選擇100 μmol/L的CoCl2作用于HLECs，成功制作了HLECs缺氧模型。檢測(cè)不同缺氧時(shí)間HLECs中的ILK，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺氧6 h時(shí)ILK表達(dá)明顯升高，隨缺氧時(shí)間延長，ILK表達(dá)逐漸增強(qiáng)并在缺氧24 h時(shí)達(dá)到最高，缺氧48 h時(shí)ILK表達(dá)下降。以上結(jié)果說明短時(shí)間的缺氧可誘導(dǎo)ILK表達(dá)增加，長時(shí)間缺氧可造成HLECs的損傷，使ILK表達(dá)下降，據(jù)此我們選擇缺氧24 h的HLECs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

為了觀察ILK的表達(dá)變化對(duì)HLECs EMT的影響，我們選擇ILK特異性抑制劑QLT0267進(jìn)行進(jìn)一步的研究[16]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，CoCl2組α-SMA、FN蛋白及其mRNA的表達(dá)均明顯增強(qiáng)；與CoCl2組比較，ILK抑制劑組α-SMA、FN蛋白及其mRNA的表達(dá)明顯減弱。這提示QLT0267通過特異性抑制ILK，抑制了HLECs中EMT早期標(biāo)志蛋白的表達(dá)，影響了EMT過程，從另一方面證實(shí)ILK在缺氧誘導(dǎo)的HLECs EMT中發(fā)揮重要作用。同前期研究[8]結(jié)果類似，QLT0267也部分抑制了CoCl2誘導(dǎo)的HLECs EMT，但并沒有全部阻斷EMT過程，說明可能有其他通路參與了CoCl2誘導(dǎo)的HLECs EMT過程。我們認(rèn)為，在HLECs EMT過程中，可能存在復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)調(diào)控通路，而ILK及其信號(hào)通路可能只是其中的一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

在很多細(xì)胞系或腫瘤細(xì)胞中，缺氧可同時(shí)誘導(dǎo)ILK和HIF-1α的表達(dá)，參與細(xì)胞EMT或腫瘤進(jìn)展。在某些細(xì)胞中，ILK可調(diào)控HIF-1α的表達(dá)[17,18]。而在少數(shù)細(xì)胞中，HIF-1α可以調(diào)控ILK的表達(dá)[19]。推測(cè)可能存在ILK-HIF-1α調(diào)節(jié)反饋回路[20]，在缺氧期間維持高水平的HIF-1α表達(dá)。缺氧不僅可以誘導(dǎo)HLECs中ILK的表達(dá)，同樣可以激活HIF-1。對(duì)于HLECs中ILK與HIF-1的調(diào)控關(guān)系尚未見報(bào)道，這需要我們進(jìn)一步深入研究，以闡明HLECs EMT的分子機(jī)制，干預(yù)HLECs EMT，預(yù)防PCO的發(fā)生。