陳 琛，趙長城2，王 勇，徐前明，劉 亞

艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)侵犯并破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)引起的疾病，對人類健康造成極大威脅。最近，以調(diào)控協(xié)同刺激分子信號通路為代表的治療策略，為改善HIV/AIDS患者的免疫功能提供了新的手段和理念。

程序性死亡受體-1(programmed death-1，PD-1)是與T淋巴細(xì)胞功能耗竭和凋亡有關(guān)的協(xié)同刺激分子，可以細(xì)胞膜型和可溶性兩種形式存在。既往對該分子的研究大多采用流式細(xì)胞術(shù)對膜型蛋白進(jìn)行測定，但對其可溶性形式(soluble PD-1，sPD-1)的表達(dá)水平及臨床意義則鮮有報(bào)道。因此，本文擬通過半定量RT-PCR法測定PD-1 mRNA的表達(dá)，并使用ELISA方法測定血清中sPD-1蛋白的表達(dá)水平，以分析其在HIV 致病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1研究對象 收集安徽省立醫(yī)院感染病院2017年6月-2017年12月HIV/AIDS病例共61例，包括31例依從性良好的接受抗病毒治療及30例未接受抗病毒治療的患者，均為男性，平均年齡40.81±14.11歲。所有病例確認(rèn)均符合中華人民共和國HIV/AIDS國家診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除梅毒、乙肝、丙肝、結(jié)核等系統(tǒng)性感染性疾病。另選健康者35例，均為男性，平均年齡42±6.38歲。本研究經(jīng)安徽省立醫(yī)院傳染病院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(No. 20161124002)，并經(jīng)患者知情同意。

1.1.2主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)?，LTS1077)；核酸提取試劑盒(廈門泰普，RNA-blood-M)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，RR036A)；內(nèi)參GAPDH引物(上海生工，B661104)；BD MultitestTMCD3/CD8/CD45/CD4(美國BD Pharmingen，340499)；人類免疫缺陷病毒I型核酸定量檢測試劑盒(廈門安普利，R2222)；Human PD-1 ELISA Kit(上海LanpaiBio公司，013655)。

表1 調(diào)查對象基本情況

Tab.1 Characteristics of the study population

項(xiàng)目例數(shù)(百分比%)年齡治療組(n=31)未治療組(n=30) <20歲4(12.90)2(6.67) 20-55歲20(64.52)20(66.67) >55歲7(22.58)8(26.6)CD4+ (個/mm3) >35010(32.26)8(26.67) <35021(67.74)22(73.33)CD4/CD8 >1.55(16.13)2(6.67) 0.5-1.517(54.84)16(53.33) <0.59(29.03)12(40.00)HIV viral loads(IU/mL) <1.00×103 18(56.07)13(43.33) 1.00×103 -1.00×1059(29.03)11(36.67) >105 4(12.90)6(20.00)

1.2.3主要儀器 TaqMan實(shí)時熒光定量RT- PCR 擴(kuò)增儀(廈門安普利9800型)；全自動核酸提取工作站(廈門安普利Anas 1000)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD公司，美國)；凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔，CLINX GenoSens1860)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)本的采集及處理 所有研究對象均為清晨空腹采血，用普通促凝真空采血管和EDTA-K2抗凝真空采血管采靜脈血各2 mL。促凝血室溫靜置30 min，2 000× g離心10 min后取血清，-80 ℃凍存?zhèn)溆?；抗凝血?biāo)本置4 ℃保存，6 h內(nèi)送檢。

1.2.2CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的測定 在流式細(xì)胞分析管中加入EDTA-K2抗凝血50 μL，按照BD MultitestTM CD3/CD8/CD45/CD4抗體試劑盒說明書，用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)。

1.2.3PD-1 mRNA水平的測定

1.2.3.1引物設(shè)計(jì)及合成 針對PD-1 基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列為：上游: 5-CGGCCAGTTCCAAACCCT-3′，下游: 5′-CCATTCCGCTAGGAAAGACA-3′。交由南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行引物合成。

1.2.3.2人外周血單個核淋巴細(xì)胞(PBMCs)的分離 按照人外周血淋巴細(xì)胞分離液說明書進(jìn)行操作。將EDTA-K2抗凝血350 × g離心10 min。將血漿棄去，保留血細(xì)胞，稀釋。加入Ficoll淋巴細(xì)胞分層液。向分層液上面的淋巴細(xì)胞層中加入清洗液10 mL，顛倒混勻。離心，倒掉上清，彈散細(xì)胞團(tuán)后，將PBMC濃度調(diào)至2.0×106·mL-1，備用。

1.2.3.3cDNA的合成 按照說明書操作，采用RNA提取試劑盒提取PBMCs中的總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將獲得的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄體系為：5× PrimeScript RT Master Mix 2 μL，Total RNA4 μL，Rnase Free ddH2O 4 μL。反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.2.3.4半定量PCR 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，同時對目的基因PD-1 和內(nèi)參基因GAPDH 進(jìn)行半定量PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 7 μL，Premix Taq 10 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，DNA模板1 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸12 s，30個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。在凝膠成像分析儀中使用Image-Pro Plus觀察擴(kuò)增得目的片段，并得出其灰度值(IOD)。

1.2.4血清sPD-1蛋白水平的測定 采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清sPD-1的濃度，操作步驟分別參照檢測試劑盒說明書進(jìn)行。簡要操作步驟如下：將sPD-1標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋，在96孔板中分別加入50 μL血清樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，室溫孵育1 h，洗滌5次，然后加入50 μL酶標(biāo)二抗室溫孵育1 h，洗滌5次，加入50 μL顯色劑避光孵育15 min，反應(yīng)結(jié)束后加入50 μL終止液，酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算血清sPD-1的濃度。sPD-1檢測試劑盒的檢測下限分別是1.2 pg/mL。

2 結(jié) 果

2.1應(yīng)用半定量RT-PCR檢測臨床標(biāo)本的結(jié)果 選擇GAPDH作為內(nèi)參基因，半定量檢測HIV/AIDS患者與健康人群PBMCs中PD-1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，未治療組、治療組、健康組相對表達(dá)量均數(shù)分別為0.337 8±0.064、0.578 2±0.073和0.771 5±0.124，健康組與未治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，健康組與治療組、治療組與未治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031、P=0.043)(圖1)。

*，P<0.05； **，P<0.01； ***，P<0.001。圖1 PD-1 mRNA在健康人群及HIV/AIDS患者的相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression of PD-1 mRNA in healthy and HIV / AIDS groups

2.2HIV/AIDS患者血清sPD-1表達(dá)水平 未治療組、治療組、健康組血清sPD-1濃度分別為42.22±2.21 ng/mL、38.24±2.79 ng/mL和29.88±1.41 ng/mL(圖2)。健康組與未治療組、治療組，治療組與未治療組分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.008、P=0.040和P=0.020)。

圖2 HIV/AIDS患者與健康人群sPD-1含量Fig.2 Concentrations of sPD-1 in serum from HIV-infected individuals and healthy controls

2.3不同CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)的HIV/AIDS患者血清sPD-1的差異 國家免費(fèi)艾滋病抗病毒藥物治療手冊[1]建議成人/青少年HIV/AIDS患者CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)低于350 個/mm3時要給予抗病毒治療。根據(jù)CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)高低，將HIV/AIDS患者治療組及未治療組分別再細(xì)分為<350 個/mm3和>350個/mm3亞組進(jìn)行差異性分析。結(jié)果表明，未治療組、治療組CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)<350 個/mm3患者血清sPD-1水平均顯著高于CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)>350 個/mm3患者(P=0.035、P=0.047)。

圖3 不同CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量水平的HIV/AIDS患者血清sPD-1Fig.3 Serum sPD-1 in HIV / AIDS patients with different CD4+T lymphocyte levels

3 討 論

近年來隨著對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制認(rèn)識的逐步深入，協(xié)同刺激分子在機(jī)體免疫中發(fā)揮的作用受到了越來越廣泛的重視。作為介導(dǎo)負(fù)性協(xié)同刺激信號的重要途徑，PD-1/PD-L1 通路在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中扮演著重要的角色，在免疫耐受、移植排斥、自身免疫性疾病以及腫瘤和慢性病毒感染等方面發(fā)揮了極為重要的生物學(xué)作用[2]。

PD-1與HIV-1感染具有緊密的聯(lián)系。謝榮華[3]等人的研究證實(shí)了PD-1是HIV 感染疾病進(jìn)展的標(biāo)志之一。另據(jù)報(bào)道，PD-1在預(yù)測HIV/AIDS患者體內(nèi)病毒儲存庫大小中具有重要作用，其表達(dá)水平與病毒反彈及耐藥存在聯(lián)系[4]。此外，Edward[5]等證實(shí)，阻斷PD-1可抑制慢性HIV感染的人源化小鼠的病毒復(fù)制。本研究通過RT-PCR法對HIV/AIDS患者PBMCs中PD-1 mRNA的表達(dá)進(jìn)行研究，與健康人群相比，PD-1 mRNA的表達(dá)下降，結(jié)果表明HIV感染可誘導(dǎo)PD-1轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)。

T細(xì)胞過度活化是HIV感染進(jìn)程中的重要特征，不能僅根據(jù)膜型分子的表達(dá)情況來判斷患者的免疫狀態(tài)[6]，因?yàn)檠芯匡@示，sPD-1參與T細(xì)胞活化的調(diào)控[7-10]?？扇苄訮D-1是由于PD-1的3號外顯子缺失(PD-1 △ex3)[11]經(jīng)翻譯后形成的蛋白。據(jù)報(bào)道，sPD-1水平在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[12]、慢性肝炎[13]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[14]等病理狀態(tài)下明顯高于健康人群。本文研究結(jié)果表明，sPD-1水平未治療組>治療組>健康組，且CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)<350 個/mm3患者血清sPD-1水平均高于CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)>350 個/mm3患者(P=0.035、P=0.047)，高水平的sPD-1可對PD-1/PD-L1通路產(chǎn)生抑制。而抗病毒治療一方面抑制病毒復(fù)制，另一方面通過下調(diào)sPD-1水平的機(jī)制來恢復(fù)PD-1/PD-L1通路，使患者免疫功能得以部分重建。從這個角度講，使用可溶性PD-1的治療可能較抗PD-1抗體更有優(yōu)勢[13]。

綜上，本文通過RT-PCR法與ELISA法證明了PD-1在HIV/AIDS患者mRNA表達(dá)下調(diào)，而sPD-1表達(dá)上調(diào)，兩者的變化表明其共同參與維持免疫系統(tǒng)平衡，為今后進(jìn)一步研究PD-1 與HIV 感染的關(guān)系提供有價值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，也為PD-1靶向診斷和治療HIV感染的策略提供了理論依據(jù)。

利益沖突：無

本文引用格式：陳琛, 趙長城, 王勇, 等. HIV/AIDS患者外周血程序性死亡受體-1的表達(dá)及臨床意義[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2019,35(4):320-323，329. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.030