蘇碩青吳同壘王洪彬孔慶山趙 飛史秋梅張志強(qiáng)

沙門菌是一種重要的人獸共患病原菌，其造成的感染較為常見和多發(fā)，給畜禽生產(chǎn)以及人類健康帶來重大威脅。在人上，沙門菌主要通過食源途徑感染，引起腹瀉、傷寒、甚至敗血癥，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，當(dāng)前世界范圍內(nèi)食源病原感染病例中，沙門菌占據(jù)第一位，年報(bào)告病例將近1 000萬人，實(shí)際病例遠(yuǎn)超此數(shù)。在我國，沙門菌感染問題也不容忽視，近年來病例報(bào)道屢見不鮮[1]。

國外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，人主要通過食源途徑感染沙門菌，而受污染的食品中，禽蛋和禽肉等禽類產(chǎn)品占據(jù)相當(dāng)大比重[2-3]。2010年，美國發(fā)生嚴(yán)重的沙門菌污染“毒雞蛋”事件，近2000人感染發(fā)病，政府被迫召回5億枚雞蛋，造成了極為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

立足于沙門菌致病機(jī)制研究，并在此基礎(chǔ)上提出科學(xué)的沙門菌防控策略，對(duì)人畜沙門菌感染防制具有重要意義。隨著對(duì)沙門菌研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)眾多毒力因子和效應(yīng)蛋白在沙門菌致病過程中發(fā)揮重要作用，這為沙門菌致病機(jī)制的完善乃至疫苗的開發(fā)提供了重要的理論參考[5]。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌上外膜蛋白YbjX與細(xì)菌毒力關(guān)系密切[6]，而大腸桿菌和沙門菌YbjX基因高度同源，暗示其可能在沙門菌上同樣有重要的作用，因此本研究以沙門菌YbjX蛋白為研究對(duì)象，通過同源重組方法缺失沙門菌上YbjX基因，并進(jìn)一步評(píng)估沙門菌各菌株的生物學(xué)特性，解析YbjX蛋白在沙門菌感染致病中的重要作用。

1 材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 禽腸炎沙門菌C50336參考菌株，pKD3、pKD46、pCP20以及pBR322質(zhì)粒由揚(yáng)州大學(xué)朱國強(qiáng)教授惠贈(zèng)；6～8周齡清潔級(jí)昆明鼠，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所(北京，中國)，試驗(yàn)前在本實(shí)驗(yàn)室自由采食喂養(yǎng)1周。

LATaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶及T4連接酶均購自TaKaRa(大連)；L-阿拉伯糖購自Sigma 公司；Minimal培養(yǎng)基按照配方配制，1L培養(yǎng)基需MgSO42 mmol/L、CaCl20.1 mmol/L、Na2PO47H2O 12.8 g、KH2PO43.0 g、NaCl 0.5 g、NH4Cl 1.0 g、葡萄糖4 g，所有試劑均購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。由河北科技師范學(xué)院動(dòng)物傳染病研究室制備并保存。

1.2λ-Red 同源重組引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI上登錄的腸炎沙門菌基因組序列(CP016754.1)設(shè)計(jì)缺失和鑒定引物(表1)，缺失引物P1、P2分別由兩部分組成，其5′ 端部分與YbjX基因序列同源，3′端部分與質(zhì)粒 pKD3氯霉素抗性基因 cat 兩側(cè)同源，P5、P6引物位于YbjX基因待敲除部分外側(cè)，用于缺失株的鑒定；P3、P4引物用于擴(kuò)增YbjX基因，構(gòu)建回補(bǔ)質(zhì)粒。所有引物由生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

表1 文章中涉及引物

Tab.1 Primers used in this study

引物名稱引物序列(5′-3′)擴(kuò)增片段長度/bpP1TGTCGCGGATTACGATCATGACA-CAGCTTACAGATAATACCTGGTA-CACTTCAGATTACGTGTAGGCTG-GAGCTGCTTCG1 132P2GCTATCGAGTAACGCATAGCG-GCGGCGATACTCGGCCCGTTTCT-TACTGGCGATCTCCGCATAT-GAATATCCTCCTTAGP3CGGGATCC ATGTCGCGGAT-TACGATCATGACAC968P4ACGCGTCGACTTAACGTTTGAAT-GTGACCGGAACCP5ACAAACCTGACGCAATAAAGAT-AG1 106/1 307?/377??P6CGCCGCTGTTCAGAAAGATG

*為一次重組擴(kuò)增片段大小，**為二次重組擴(kuò)增片段大小

1.3腸炎沙門菌YbjX基因缺失株的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)描述方法，將含有pKD46質(zhì)粒的腸炎沙門菌C50336菌株接種于LB中，添加終濃度為30 mmol/L L-阿拉伯糖30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)，待菌液OD600 nm達(dá)到0.4-0.6時(shí)，收集菌體，預(yù)冷10%甘油洗滌三次，制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)。將P1、P2擴(kuò)增純化的打靶片段電轉(zhuǎn)化到制備好的感受態(tài)細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)化條件為電壓1.8 kV，脈沖25 μF，電阻200Ω挑取氯霉素抗性菌落進(jìn)行鑒定。陽性菌落制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，導(dǎo)入pCP20質(zhì)粒，消除抗性標(biāo)記，最終得到目的菌株(c50336ΔYbjX(KO)?；蛉笔Ь昀肞CR方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4回補(bǔ)菌株構(gòu)建 以腸炎沙門菌基因組其為模板，利用P3、P4引物擴(kuò)增YbjX基因片段(含啟動(dòng)子序列)，將其克隆到pBR322質(zhì)粒上。將回補(bǔ)質(zhì)粒pBR322-YbjX轉(zhuǎn)化至c50336ΔYbjX突變菌株中，構(gòu)建回補(bǔ)菌株c50336ΔYbjX/pBR322-YbjX(RC)。

1.5生長特性檢測 分別將腸炎沙門菌野生型菌株、YbjX基因缺失株和回補(bǔ)菌株接種液體LB中，37 ℃振搖培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接新鮮液體LB，初始濃度調(diào)整為106cfu/mL，37 ℃同步振搖培養(yǎng)；每隔2 h吸取菌液樣品，測量600 nm處吸光度，重復(fù)上述試驗(yàn)3次，根據(jù)所得細(xì)菌數(shù)繪制生長速率曲線，比較兩株細(xì)菌的生長速度。在Minimal培養(yǎng)基上重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。

1.6生化特性測定 參照文獻(xiàn)描述[7]方法利用梅里埃自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)對(duì)C50336野生型菌株、YbjX基因缺失株進(jìn)行生化特性比較。

1.7耐藥性鑒定 參照NCCLS藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，利用K-B紙片法對(duì)目的菌株進(jìn)行藥物敏感性測試，質(zhì)控菌為大腸桿菌菌株ATCC25922。分別將腸炎沙門菌YbjX基因缺失株和野生型菌株接種液體LB中，37 ℃培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物調(diào)整至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?，無菌棉簽將細(xì)菌涂布于無抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，并在培養(yǎng)基表面貼上藥敏紙片，培養(yǎng)24 h測定藥敏紙片的抑菌圈直徑，以檢測抗生素對(duì)該菌的抑制程度。試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果為測量平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.8腸炎沙門菌抗血清殺傷能力檢測 參照文獻(xiàn)描述方法[8]，將腸炎沙門菌各菌株與健康成年雞血清共孵育，評(píng)估其抗血清殺傷能力，本研究主要評(píng)測補(bǔ)體對(duì)沙門菌的殺傷作用，用全菌ELISA未檢測到血清中腸炎沙門菌抗體。計(jì)算細(xì)菌存活率(當(dāng)前菌數(shù)/初始菌數(shù))×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用prism 5.0軟件分析。

1.9腸炎沙門菌抗蛋清殺傷能力檢測 參照文獻(xiàn)[9]方法，將腸炎沙門菌各菌株培養(yǎng)物稀釋至2×103cfu/mL～4×103cfu/mL后加入1.5 mL蛋清液中充分混勻，于不同時(shí)間點(diǎn)取30 L涂布平板計(jì)數(shù)，記錄不同孵育時(shí)間活菌數(shù)與初始活菌數(shù)之比，計(jì)算各菌株存活率。本研究所用蛋清取自SPF雞胚，ELISA未檢測到腸炎沙門菌抗體。

1.10巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力測定 參照文獻(xiàn)描述方法[11]，測定腸炎沙門菌各菌株在鼠源巨噬細(xì)胞Raw264.7內(nèi)的存活和增殖情況，通過測定胞內(nèi)增殖率(23 h菌數(shù)/3 h菌數(shù))，評(píng)估各菌株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力。

1.11細(xì)菌致病力的測定 參照文獻(xiàn)描述方法[11]，利用昆明鼠模型測定腸炎沙門菌各菌株的LD50，以評(píng)估各菌株的致病力。

2 結(jié) 果

2.1腸炎沙門菌c50336YbjX基因缺失株的構(gòu)建

對(duì)腸炎沙門菌C50336進(jìn)行缺失操作，獲得一次重組菌株C50336ΔYbjX::cat和二次重組菌株C50336ΔYbjX。分別以野生型菌株、構(gòu)建的一次重組株和二次重組株為模板，利用特異性鑒定引物擴(kuò)增YbjX基因。結(jié)果顯示，對(duì)照野生株擴(kuò)增片段為1 100 bp，一次重組菌株和二次重組菌株擴(kuò)增片段分別為1 300 bp和380 bp，與預(yù)期一致(圖1)；進(jìn)一步對(duì)二次重組菌株YbjX基因進(jìn)行測序分析表明，經(jīng)過二次重組，C50336ΔYbjX菌株YbjX基因中待缺失序列已被敲除。

M. DL2000 plus Marker; 1. C50336; 2. C50336YbjX::cat; 3. C50336ΔYbjX圖1 腸炎沙門菌ΔYbjX基因缺失株的驗(yàn)證Fig.1 Identification of the knockout ofYbjX gene inSalmonella enteritidisstrains by PCR

2.2YbjX基因缺失對(duì)腸炎沙門菌生長特性的影響 測定腸炎沙門菌野生型菌株、YbjX基因缺失菌及回補(bǔ)菌株在普通LB(圖2A)培養(yǎng)基和限制性培養(yǎng)基Minimal(圖2B)中的生長情況，結(jié)果顯示，3株菌生長速度無明顯差異。

2.3YbjX基因缺失對(duì)腸炎沙門菌生化特性的影響 利用ATB全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)測定腸炎沙門菌c50336菌株與YbjX基因缺失株的生化反應(yīng)譜，結(jié)果顯示：二者生化反應(yīng)譜無區(qū)別，均能利用葡糖糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇、檸檬酸鹽，不能發(fā)酵蔗糖，它們的生化特性基本一致，說明YbjX基因缺失后不影響腸炎沙門菌的生化特性。

2.4腸炎沙門菌ΔYbjX 基因缺失株耐藥性分析 藥敏試驗(yàn)結(jié)果(見表2)表明，相較于野生型菌株，ΔYbjX基因缺失株對(duì)多種抗生素敏感增強(qiáng)，揭示YbjX基因缺失對(duì)腸炎沙門菌耐藥性產(chǎn)生影響。

WT： C50336 野生型菌株KO： C50336ΔYbjX基因缺失菌株RS： C50336ΔYbjX/pBR322-YbjX回補(bǔ)菌株A：LB培養(yǎng)條件下生長曲線測定 B：Minimal 培養(yǎng)條件下生長曲線測定A：Growth curve in LB-medium; B： Growth curve in Minimal medium圖2 腸炎沙門菌生長曲線測定Fig.2 Growth characteristics of C50336 isogenic deletion strains

表2 腸炎沙門菌C50336 ΔYbjX基因缺失株和野生型菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Resistance to antibotics ofSalmonellaC50336 ΔYbjX mutant and wild-type strains

抗生素抑菌圈直徑/mmC50336C50336ΔYbjX多粘菌素B11.67±0.5815.33±0.58氨芐青霉素14.83±0.7621.67±0.58頭孢拉定12.50±0.5017.33±0.29環(huán)丙沙星21.67±0.5830.67±1.53氯霉素16.50±0.5020.17±1.04卡那霉素11.67±0.5814.67±0.58四環(huán)素12.67±0.5819.67±0.58慶大霉素13.83±0.7613.67±0.58

重復(fù)三次藥敏試驗(yàn)，結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

2.3YbjX基因缺失對(duì)腸炎沙門菌巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力的影響 將腸炎沙門菌野生型菌株、YbjX基因缺失菌株和回補(bǔ)菌株等量感染鼠源巨噬細(xì)胞Raw264.7，測定3者在鼠源巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力。結(jié)果顯示，野生型細(xì)菌在Raw264.7細(xì)胞內(nèi)的增殖率(23 h/3 h)達(dá)到40多倍，而對(duì)應(yīng)的YbjX基因缺株在Raw264.7細(xì)胞內(nèi)的增殖率(23 h/3 h)率約26倍(圖3)，下降顯著(P<0.05)。上述結(jié)果表明，YbjX蛋白參與調(diào)控腸炎沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活和增殖。

圖3 YbjX基因缺失對(duì)腸炎沙門菌C50336在巨噬細(xì)胞Raw264.7胞內(nèi)存活的影響Fig.3 Survival analysis of C50336 isogenic deletion strains by Raw264.7 cells

2.6YbjX基因缺失對(duì)腸炎沙門菌血清和蛋清生存的影響 將腸炎沙門菌野生型菌株、YbjX基因缺失株及回補(bǔ)菌株與健康雞血清混合，評(píng)測其在血清中生存的影響，結(jié)果(圖4A)顯示，野生型菌株能夠在雞血清中很好的增殖，而YbjX基因缺失株生長速率遠(yuǎn)低于野生型菌株，回復(fù)菌株血清生存能力得到部分恢復(fù)。

進(jìn)一步，我們檢測了腸炎沙門菌各菌株在蛋清中存活能力。結(jié)果表明(圖4B)YbjX基因缺失后腸炎沙門菌在蛋清內(nèi)的存活能力顯著下降，證明YbjX蛋白參與腸炎沙門菌的蛋內(nèi)存活。

2.7YbjX基因缺失對(duì)腸炎沙門菌毒力的影響 利用小鼠模型測定腸炎沙門菌野生型菌株和YbjX基因缺失株的LD50，C50336和缺失菌株的LD50分別為3.98×105和1.43×107cfu，表明缺失株毒力顯著下降，揭示YbjX基因與腸炎沙門菌毒力間的密切聯(lián)系。

A：雞血清存活實(shí)驗(yàn)； B：小鼠血清存活實(shí)驗(yàn)A, Survival assay in chicken serum; B, Survival assay in mouse serum圖4 YbjX基因缺失對(duì)腸炎沙門菌血清生存的影響Fig.4 Serum survival assay ofS.enteritidisC50336 andYbjX-deficient mutant

3 討 論

動(dòng)物產(chǎn)品是人感染沙門菌的主要來源，從動(dòng)物源頭上嚴(yán)控沙門菌污染是預(yù)防人感染沙門菌的最有效手段。但事實(shí)上，這項(xiàng)工作還有許多問題有待解決。在畜牧生產(chǎn)上，沙門菌感染問題復(fù)雜且嚴(yán)重。沙門菌往往對(duì)幼齡動(dòng)物造成嚴(yán)重疾病，引起幼齡動(dòng)物腹瀉、敗血癥，造成高淘汰率；而在成年動(dòng)物則多為無癥狀感染，感染動(dòng)物雖長期帶菌，卻不表現(xiàn)癥狀或癥狀輕微，特別是沙門菌可以垂直傳播，這給沙門菌的診斷和防控帶來極大困難[10]。深入研究沙門菌的致病機(jī)制，對(duì)于探索沙門菌感染防控的新技術(shù)具有重要意義。YbjX是存在于革蘭氏陰性細(xì)菌表面的外膜蛋白，在耶爾森菌上的一項(xiàng)研究表明，YbjX蛋白的表達(dá)受雙組份調(diào)控系統(tǒng)PhoP/Q所調(diào)控，而該系統(tǒng)參與細(xì)菌毒力的調(diào)控[11]。前期在大腸桿菌上的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，YbjX與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)[6]，那么YbjX是否參與沙門菌的致病過程？發(fā)揮何種作用？為了回答這些問題，本研究構(gòu)建了腸炎沙門菌YbjX基因缺失菌株和回補(bǔ)菌株，并進(jìn)一步分析其生物學(xué)特性。我們發(fā)現(xiàn)，YbjX蛋白失活后，腸炎沙門菌的生長和生化特性并無明顯變化，表明該蛋白并不參與細(xì)菌的基礎(chǔ)代謝過程。作為典型的胞內(nèi)致病菌，沙門菌胞內(nèi)存活特別是巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力對(duì)于其感染致病至關(guān)重要，是沙門菌長期存活難以根除的重要原因[12]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)將YbjX蛋白失活后，腸炎沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力大幅下降，揭示其可能在沙門菌宿主內(nèi)存活過程中發(fā)揮重要作用。敗血性細(xì)菌能夠抵御宿主血清殺傷造成系統(tǒng)感染[11]，沙門菌亦可引發(fā)敗血癥，本研究發(fā)現(xiàn)YbjX基因缺失后，沙門菌在血清中增殖能力被大幅度削弱，造成敗血感染的能力有所下降。蛋清中的溶菌酶和轉(zhuǎn)鐵蛋白等殺菌物質(zhì)能夠?qū)?xì)菌進(jìn)行殺傷，而在長期的進(jìn)化過程中，沙門菌能夠抵御蛋清殺傷從而得以在蛋內(nèi)長期存活，這是其造成垂直傳播以及食品安全隱患的重要原因，本研究中我們發(fā)現(xiàn)，YbjX基因缺失后，沙門菌在蛋清內(nèi)的存活能力顯著下降，這與前人的報(bào)道一致。前期研究發(fā)現(xiàn)YbjX與細(xì)菌對(duì)抗β防御素過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]，進(jìn)一步研究表明，YbjX參與細(xì)菌對(duì)抗多粘菌素B的殺傷[4]，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，且進(jìn)一步的我們發(fā)現(xiàn)YbjX參與細(xì)菌對(duì)抗多種抗生素，其機(jī)制有待于進(jìn)一步挖掘?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，我們認(rèn)為YbjX可能參與沙門菌多種生命進(jìn)程，并與其致病性相關(guān)。因此，我們進(jìn)一步利用小鼠模型評(píng)估YbjX基因缺失腸炎沙門菌致病性的影響，如我們所預(yù)期的，YbjX基因缺失后腸炎沙門菌對(duì)小鼠致病力顯著下降。

綜上所述，我們認(rèn)為外膜蛋白YbjX與腸炎沙門菌的胞內(nèi)存活、抗生素耐受性以及細(xì)菌毒力密切相關(guān)，在沙門菌的致病過程中發(fā)揮重要作用。本項(xiàng)研究為沙門菌致病機(jī)制研究和疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

利益沖突：無

本文引用格式：李永慧, 蘇碩青, 吳同壘, 等. 腸炎沙門菌YbjX基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2019,35(4): 324-329. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.031