劉峰顏蘋蘋王征樺謝美榕嚴(yán)延生

隨著我國艾滋病(AIDS)疫情的不斷上升以及免費抗病毒治療標(biāo)準(zhǔn)的進一步放寬(發(fā)現(xiàn)即治療)[1]，越來越多的HIV/AIDS患者納入治療，HIV耐藥的產(chǎn)生和傳播將不可避免。HIV耐藥性已逐漸成為威脅抗病毒治療可持續(xù)性發(fā)展的主要因素。國際AIDS協(xié)會已推薦將HIV耐藥性檢測納入AIDS的臨床管理中[2]。此外，隨著治療時間的延長以及新藥的研發(fā)和應(yīng)用，新的耐藥突變位點將不斷產(chǎn)生及突變位點之間的相互作用更加復(fù)雜化，這對現(xiàn)有HIV耐藥檢測技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)。目前國際上發(fā)展較為成熟并且應(yīng)用于臨床的有基因型和表型耐藥檢測?；蛐湍退帣z測由于具有簡便、快速、費用低等優(yōu)點常用于臨床耐藥檢測，但是在對復(fù)雜突變點組合的判斷、突變點之間相互作用、新的耐藥突變位點鑒定等情況，無法提供可靠的耐藥信息，對結(jié)果解釋比較困難?；诖?表型耐藥檢測方法將發(fā)揮重要作用。目前商業(yè)化表型耐藥檢測試劑盒主要有Virologic 公司的PhenoSenseGTTM系統(tǒng)，VIRCO公司的Antivirogram系統(tǒng)和法國Viralliance 公司的PhenoScript TM系統(tǒng)[3]。雖然，商業(yè)化試劑盒在很大程度上簡化了檢測步驟，提高了檢測的可重復(fù)性，但并未明顯地降低檢測的周期，更重要的是其耐藥檢測范圍比較小。為此，本研究將在前期自我構(gòu)建的HIV-1表型耐藥檢測系統(tǒng)(pLWJ-SV40-Luc+/VSV-G)[4]基礎(chǔ)上對骨架質(zhì)粒pLWJ-SV40-Luc進行改造，同時引進In-fusion 定向連接克隆技術(shù)替代酶切連接，以便通過優(yōu)化降低本底質(zhì)粒污染，同時實現(xiàn)高通量快速無縫連接，并將其應(yīng)用于臨床樣本檢測，通過表型與基因型耐藥檢測結(jié)果比較以評估其臨床應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1臨床樣本來源 研究對象來自福建省接受抗病毒治療失敗和未治療的HIV/AIDS患者的EDTA抗凝全血，分裝血漿，凍存于-80 ℃。

1.2主要材料與試劑 膜蛋白表達質(zhì)粒VSV-G，293T細胞，HIV骨架質(zhì)粒pLWJ-SV40-Luc由本實驗室構(gòu)建并保存[5]；pUC-19質(zhì)粒、In-fusion無縫連接酶、E.coli DH5α(寶生物,大連)；BshTI(AgeI)和AarI限制性內(nèi)切酶(Fermentas，美國)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司，美國)；Bright-GLoTM熒光素酶檢測系統(tǒng)(Promega公司，美國)；QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑(Qiagen公司，德國)；引物合成與測序由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成；

1.3新的HIV耐藥檢測骨架載體的構(gòu)建 以pUC-19質(zhì)粒為模板擴增LacZ基因片段，上游引物5In LacZ：5′-GACTATGTAGACCGGTTTTACACTTTATGCTTCCGGCT-3′，下游引物3InLacZ：5′-CACCTGCCATCTGTTCTATGCGGCATCAGAGCAG-3′。反應(yīng)條件為98 ℃2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃15 s，68 ℃ 30 s，30個循環(huán)；68 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物切膠回收。將HIV-1骨架載體pLWJ-SV40-Luc經(jīng)AgeI/AarI雙酶切，純化回收線性化載體，利用In-fusion無縫連接酶與LacZ基因進行連接，50 ℃ 15 min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，次日挑取藍色菌落，搖菌提取質(zhì)粒用AgeI/AarI雙酶切進行鑒定，將酶切正確的陽性克隆進行雙向測序鑒定。

1.4耐藥檢測片段的擴增 擴增所用引物，內(nèi)外側(cè)上游引物AgeI：5′-ACCCTTTAGAGACTATGTAGACCGGTTCTWTAAAACTYTMAGAG-3′；外側(cè)下游引物Vif-HB：5′-CCTTTTCTCCTGTCTGCAGACCCCAATATG-3′；內(nèi)側(cè)下游引物AarI：5′-GTCTACTTGCCACACAATCAKCACCTGCCATCTGTTTTC-3′。擴增區(qū)域(共3 364 bp)包括：Gag區(qū)p7-p1-p6 protease cleavage sites，全長PR、RT、RNase及Integrase的1-280aa。提取血漿病毒RNA，進行RT-nested PCR擴增。第一輪擴增引物為AgeI/Vif-HB，反應(yīng)條件為94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 4 min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。第二輪擴增引物為AgeI /AarI，反應(yīng)條件為94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 4 min 35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物送上海鉑尚生物有限公司進行測序。將序列進行拼接、編輯整理后上傳到斯坦福大學(xué)HIV 耐藥數(shù)據(jù)系統(tǒng)進行耐藥相關(guān)突變分析。

1.5耐藥檢測載體(RTV)的構(gòu)建 將新的HIV耐藥檢測骨架載體pLWJ-SV40-Luc-LacZ經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶(AgeI/AarI)進行雙酶切，純化回收線性化載體，并與純化后的耐藥檢測片段按一定比例用In-fusion無縫連接酶進行定向連接，50 ℃ 15 min，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂板于已加入X-gal和IPTG的kan+抗性LB平板，次日挑取白色菌落進行菌落PCR鑒定。挑取PCR擴增正確的陽性克隆菌落，搖菌培養(yǎng)，次日提質(zhì)粒鑒定，將陽性質(zhì)粒(即耐藥檢測載體)進行測序證實。主要構(gòu)建流程(圖1)如下。

圖1 耐藥檢測載體(RTV)的構(gòu)建Fig.1 Flow chart for the construction of the RTV

1.6HIV假病毒感染活性的鑒定 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將耐藥檢測載體RTV和膜蛋白表達質(zhì)粒VSV-G，按質(zhì)量比2∶1的比例共轉(zhuǎn)染293T細胞，制備HIV-1假病毒，同時設(shè)HIV骨架質(zhì)粒載體作為對照。按LipofectamineTM2000(invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行操作。轉(zhuǎn)染48 h后收集上清，經(jīng)0.45 μm濾器過濾，將部分過濾的轉(zhuǎn)染上清(即HIV假病毒)感染293T細胞，培養(yǎng)48～72 h后，收集感染細胞，利用Bright-Glo Luciferase Assay試劑測定每孔感染細胞的螢光素酶(Luc+)的相對熒光單位(RLU)來鑒定假病毒感染活性。

1.7 HIV表型耐藥檢測

1.7.1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑藥物敏感性檢測 本研究采用的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑有AZT、TDF、3TC、NVP、EFV。將藥物按10×倍比稀釋鋪入96孔板中，終體積為50 μL，其中用50 μL DMEM培養(yǎng)基替代藥物作為空白對照；每孔加入200TCID50HIV假病毒和5×104個293T細胞。每個藥物稀釋度均設(shè)3個復(fù)孔。置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48～72 h后，利用Bright-Glo Luciferase Assay試劑測定每孔細胞中相對熒光單位(RLU)。

1.7.2蛋白酶抑制劑的藥物敏感性檢測 本研究采用的蛋白酶抑制劑為LPV/r。將各臨床樣本構(gòu)建好的耐藥檢測載體按上述方法進行轉(zhuǎn)染試驗，轉(zhuǎn)染6 h后，棄上清，將藥物按10×倍比稀釋加入96孔板中，終體積為100 μL，其中用100 μL DMEM培養(yǎng)基替代藥物作為空白對照。每個藥物稀釋度均設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)48～72 h后取上清100 μL感染新鮮的293T細胞，培養(yǎng)48～72 h后，利用Bright-Glo Luciferase Assay試劑測定每孔細胞中相對熒光單位(RLU)。

以上實驗均設(shè)HIV骨架質(zhì)粒pLWJ-SV40-Luc/VSV-G作為敏感株進行平行對照。

1.8穩(wěn)定性實驗 利用新HIV耐藥檢測骨架載體構(gòu)建的RTV在不同時間重復(fù)4次測定不同藥物的敏感性實驗，以評估載體的穩(wěn)定性。

1.9表型耐藥結(jié)果分析 數(shù)據(jù)分析利用GraphPad Prism Software 5.01軟件，采用非線性回歸分析中劑量反應(yīng)-抑制率來分析藥物半數(shù)抑制劑量(IC50)及藥物抑制曲線。抑制率計算公式：

2 結(jié) 果

2.1新HIV耐藥檢測骨架載體的構(gòu)建 以pUC-19質(zhì)粒為模板用引物5InLacZ/3InLacZ擴增LacZ基因片段，大小約為460 bp，其中包含了能夠表達LacZ包括啟動子在內(nèi)的完整片段、兩端具有能夠與骨架酶切載體連接的15 bp同源序列。利用In-fusion無縫連接酶，將純化后的LacZ基因片段和經(jīng)AgeI/AarI雙酶切后的HIV骨架載體pLWJ-SV40-Luc連接起來，構(gòu)建新的HIV耐藥檢測骨架質(zhì)粒pLWJ-SV40-Luc-LacZ。挑取藍色菌落提質(zhì)粒進行AgeI/AarI雙酶切鑒定，切下的片段大小約460 bp左右與預(yù)期相符。經(jīng)過測序證實LacZ基因已成功替換原骨架載體的目標(biāo)片段。

2.2HIV-1耐藥檢測片段的擴增及耐藥相關(guān)突變位點的分析 用耐藥擴增引物共擴增了抗病毒治療前后臨床標(biāo)本36份(治療前6份和治療后30份)，擴增片段大小約3 364 bp，如圖2，陽性擴增樣本有30份，總擴增率為83.33%。

1：15 000 marker 2：YYL 3：HXM 4：DLJ 5：XYQ 6：CLM 7：ZZ 8： HJY 9：HYZ 10：HJW 11：LQQ 12：ZKZ 13：negative control圖2 HIV耐藥檢測片段擴增Fig.2 PCR amplification of target fragments for HIV drug resistance test

2.3表型耐藥檢測載體的構(gòu)建及其感染活性的鑒定 將純化后的陽性耐藥檢測片段和經(jīng)AgeI/AarI酶切后的新HIV骨架質(zhì)粒載體pLWJ-SV40-Luc-LacZ通過In-fusion無縫連接將耐藥檢測片段替換骨架質(zhì)粒載體上對應(yīng)LacZ片段，構(gòu)建相應(yīng)的耐藥檢測載體RTV。通過藍白斑篩選，各挑取10～20個白斑作菌落PCR鑒定(圖3)，擴增片段大小若約為5 000 bp，則預(yù)示表型耐藥檢測載體構(gòu)建成功。最后經(jīng)測序證實有26例臨床樣本成功構(gòu)建出表型耐藥檢測載體，成功構(gòu)建率是86.7%。假病毒感染活性實驗結(jié)果顯示有21例臨床耐藥樣本表型耐藥檢測載體產(chǎn)生的假病毒具有感染活性。

1：15 000 marker；2-21為YYL1-20不同克隆株；22-25為HXM1-4不同克隆株圖3 菌落PCR鑒定表型耐藥檢測載體構(gòu)建情況Fig.3 Identification of phenotypic resistance test vector by colony PCR

2.4HIV基因型耐藥檢測結(jié)果 HIV耐藥相關(guān)突變位點分析結(jié)果顯示：21例樣本中有16例發(fā)生了HIV耐藥相關(guān)突變，其中15例發(fā)生1個及以上逆轉(zhuǎn)錄酶耐藥相關(guān)突變，但只有1例發(fā)生蛋白酶次要相關(guān)突變Q58E，詳見表1。從亞型分析顯示本研究樣本亞型涵蓋我省絕大多數(shù)流行亞型，其中12例CRF01_AE，4例CRF07_BC，2例CRF55_01B，CRF08_BC、B、C各1例?；蛐湍退幏治鼋Y(jié)果顯示：有7例針對1種及以上核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥，9例對2種非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NVP和EFV)均耐藥，21例均對蛋白酶抑制劑(LPV/r)敏感，結(jié)果詳見表2。

2.5HIV表型耐藥檢測結(jié)果 將上述構(gòu)建的具有感染活性的21例臨床表型耐藥檢測載體進行藥物敏感性實驗，由于所構(gòu)建的HIV骨架質(zhì)粒pLWJ-SV40-Luc+對所有藥物均敏感，故將其作為野生型參考株進行對照。最終表型耐藥結(jié)果是將其IC50與野生株的IC50進行比較，用IC50的倍增值(即FC值)來表示，結(jié)果見表2。

2.6HIV表型與基因型耐藥檢測結(jié)果比較分析 將表型耐藥結(jié)果判定原則定為與野生株IC50相比，其FC值<4為敏感，>4倍為耐藥。按照此判定原則，將表型與基因型耐藥檢測結(jié)果進行比較分析顯示:本研究21例樣本對6種國內(nèi)常用抗病毒藥物的表型耐藥檢測結(jié)果與基因型耐藥檢測結(jié)果完全一致,見表3。

2.7穩(wěn)定性實驗結(jié)果 隨機抽取1例用新HIV耐藥檢測骨架載體構(gòu)建的RTV在不同時間重復(fù)4次測定其對6種藥物(3TC、TDF、AZT、LPV、EFV、NVP)的敏感性實驗以評價此系統(tǒng)的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示該表型耐藥檢測系統(tǒng)具有較高的穩(wěn)定性，見表4。

3 討 論

本研究通過對骨架質(zhì)粒pLWJ-SV40-Luc進行改造，將LacZ藍白斑篩選基因替換了原骨架質(zhì)粒內(nèi)表型耐藥檢測區(qū)域(包括Gag區(qū)p7-p1-p6 protease cleavage sites，全長PR、RT、RNase及Integrase的1-280aa共3364bp)，從而構(gòu)建新的HIV耐藥檢測骨架質(zhì)粒pLWJ-SV40-Luc-LacZ。在此基礎(chǔ)上將來自臨床樣本的耐藥檢測片段替換新骨架質(zhì)粒內(nèi)的LacZ基因片段，進而構(gòu)建耐藥檢測載體RTV。由于AgeI和AarI在雙酶切體系中效率分別為20%～50%和50%～100%，用此雙酶切線性化舊的骨架質(zhì)粒pLWJ-SV40-Luc時由于酶切不完全難以避免來自于本底骨架質(zhì)粒的影響，最后構(gòu)建出的RTV只能通過KpnI或XbaI單酶切或測序進行鑒別[5]。然而，通過此改造一方面避免來自本底骨架質(zhì)粒pLWJ-SV40-Luc的影響，另一方面可通過藍白斑篩選進行初篩，再通過菌落PCR即可完成對RTV的鑒定篩選，這不僅縮短檢測時間、減少工作量、整體上提高了實驗效率，而且也降低了實驗成本；此外，通過引進In-fusion無縫克隆技術(shù)，不僅改善了克隆條件，50 ℃ 15 min即可完成定向克隆，便捷、高效且穩(wěn)定，而且無需受酶切位點的限制，適用于任何載體，從而提高了RTV的構(gòu)建效率，實現(xiàn)基因克隆的高通量。

表1 21份臨床樣本基因型耐藥突變位點分析結(jié)果

Tab.1 Analysis of drug resistant-associated mutant loci in 21 clinical samples

Patient ID病毒載量(copies/mL)subtypePR MutationsRT MutationsmajorminorNRTINNRTIYYL/CRF07_BCnoneQ58ENoneNoneHXM4.01E+04CRF55_01BnonenonenoneE138G, V179EDLJ1.04E+04CRF01_AEnonenoneM184VnoneXYQ5.67E+04CRF01_AEnonenoneM184VY181C, G190ACLM4.97E+05CRF01_AEnonenoneM184VK101E, G190SZZR2.56E+05CRF01_AEnonenoneD67N, K70R, T215F, K219EY181I, N348IHJY3.43E+03CRF01_AEnonenoneM184VK101E, G190AHYZ/CRF01_AEnonenonenoneV179EHJW/CRF01_AEnonenoneT69GV179E, Y181CLQQ2.01E+04CRF07_BCnonenoneK219RnoneZKZ8.26E+04CnonenoneM184VK103NRLW9.41E+05CRF01_AEnonenonenoneY181CZLW/BnonenonenonenoneWKZ2.87E+03CRF01_AEnonenonenonenoneWXW/CRF07_BCnonenonenonenoneHJL/CRF08_BCnonenoneV75AnoneCJ1.88E+03CRF01_AEnonenonenonenoneQYE6.24E+03CRF01_AEnonenoneM184VK103NZMM4.79E+04CRF07_BCnonenonenoneP236LYY/CRF01_AEnonenonenoneV179TWFQ2.93E+03CRF55_01BnonenoneK219RV179E, P236L

注：“/”表示未檢測。

表2 基因型與表型耐藥檢測結(jié)果比較

Tab.2 Comparison of phenotypic resistance test results and genotypic resistance test results

IDGenotypic Resistance(Level)Phenotypic Resistance(Level: Fold Increase of IC50)AZT3TCTDFEFVNVPLPV/rAZT3TCTDFEFVNVPLPV/rYYLSSSSSS 1.33 1.14 1.23 3.67 0.710.88HXMSSSLLS1.831.501.5811.67261.671.00DLJSHSSSS1.5074.320.65 2.67 1.661.38XYQSHSHHS2.8350.500.7794.00952.020.81CLMSHSHHS3.17197.323.38863.67919.251.19ZZRHPIIHS13.333.0023.00>1 000>1 0001.38HJYSHSHHS2.0041.363.31766.67381.581.69HYZSSSPPS3.670.911.77 3.00 1.141.19HJWPSSIHS2.173.861.5842.33>1 0001.13LQQPSSSSS3.001.591.58 3.33 0.831.63ZKZSHSHHS1.5043.363.19>1 000>1 0001.31表2(續(xù))IDGenotypic Resistance(Level)Phenotypic Resistance(Level: Fold Increase of IC50)AZT3TCTDFEFVNVPLPV/rAZT3TCTDFEFVNVPLPV/rRLWSSSIHS1.501.591.5435.67>1 0000.44ZLWSSSSSS2.333.002.77 3.33 1.540.44WKZSSSSSS2.673.773.12 3.33 1.950.69WXWSSSSSS2.830.682.35 2.67 1.740.63HJLSSSSSS0.671.001.96 3.33 0.161.00CJSSSSSS2.332.862.65 3.00 1.510.38QYESHSHHS2.8346.453.23>1 000494.311.25ZMMSSSSSS0.671.092.12 3.33 0.181.38YYSSSSSS1.000.951.88 2.67 0.591.31WFQPSSPPS2.671.002.04 3.67 1.481.69

表3 表型耐藥檢測結(jié)果與基因型耐藥結(jié)果的比較

Tab.3 Comparison between phenotypic and genotypic resistance testing results

耐藥檢測結(jié)果各類藥物檢測例數(shù)基因型檢測結(jié)果表型檢測結(jié)果AZT3TCTDFEFVNVPLPV/r耐藥耐藥161990敏感敏感201520121221耐藥敏感000000敏感耐藥000000

表4 新的表型耐藥檢測系統(tǒng)穩(wěn)定性分析

Tab.4 Stability analysis of the new phenotypic resistance testing system

藥物名稱IC50(μmol/L)1234xμmol/LSCV3TC0.6970.8710.4560.5450.642 20.182 128.35%TDF0.0080.0060.0040.0060.005 80.016 728.75%AZT0.0170.0280.0260.0300.025 30.005 722.72%EFV0.002 10.001 70.001 50.001 40.001 70.000 319.72%NVP666.74892.05543.07883.76746.40171.0522.92%LPV/r0.0130.0160.020.0170.016 50.002 917.49%

HIV復(fù)制過程中有三個關(guān)鍵酶，即逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase,RT)、蛋白酶(protease,PR)及整合酶(integrase)，它們均為目前抗艾滋病毒藥物的主要攻擊靶標(biāo)。目前除了在這些藥物作用主要靶點檢測到耐藥突變外，還在gag區(qū)剪切位點處(p7/p1/p6)檢測到耐藥相關(guān)突變位點的存在，由于HIV-1蛋白酶負(fù)責(zé)病毒的gag和gag-pol多聚蛋白的翻譯后加工，因此該區(qū)域突變有可能導(dǎo)致對蛋白酶抑制劑耐藥[6]。雖然有些新發(fā)展的檢測技術(shù)已經(jīng)考慮到將Gag 以及 Gag-Pol 剪切位點納入耐藥檢測的范圍[7]，然而目前絕大多數(shù)耐藥檢測方法仍然僅對RT和PR進行耐藥檢測，其中應(yīng)用到臨床表型耐藥檢測的試劑盒AntivirogramTM(VircoMechelen, Belgium)僅包含蛋白酶和絕大部分的逆轉(zhuǎn)錄酶(codons 1482)[8]；PhenoSenseTM(ViroLogic South San Francisco, Calif)也僅包含有部分gag，全部蛋白酶和針對313密碼子的RT區(qū)域[9]。本研究構(gòu)建的HIV表型耐藥檢測方法不僅可檢測到全長的PR、RT、RNase以及Integrase的1-280aa還可檢測到gag 區(qū)中蛋白酶剪切位點p7-p1-p6。因此該耐藥檢測系統(tǒng)能夠只利用一次重組后的假病毒就可檢測包括所有蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶抑制劑等目前國家常用藥物的主要靶點，從而實現(xiàn)藥物檢測的高通量。

研究結(jié)果顯示表型與基因型耐藥檢測結(jié)果能夠很好的吻合，且具有較高的穩(wěn)定性，充分證明了所建立的新的HIV-1表型耐藥檢測系統(tǒng)可應(yīng)用于臨床耐藥檢測，為HIV/AIDS患者尤其是對基因型結(jié)果難以解釋的病例提供更為高效、快捷的耐藥檢測平臺，同時也為開展耐藥相關(guān)突變位點的研究以及新的抗病毒治療藥物的研發(fā)等提供一個技術(shù)平臺。

研究不足之處，耐藥檢測片段擴增效率不是特別高，僅為83%，其中原因除了與擴增片段相對比較長(約3 364 bp)、引物與少數(shù)模板不匹配有關(guān)外，還有可能與樣本低病毒載量和樣本保存條件有關(guān)。另外，部分構(gòu)建的RTV產(chǎn)生的假病毒沒有感染活性可能原因是受到HIV-1準(zhǔn)種的影響，或者在PCR過程中不可避免發(fā)生突變而表現(xiàn)為復(fù)制能力較差或缺陷。為此，為了提高檢測效率，樣本最好新鮮采集或按要求-80 ℃低溫保存，盡可能選擇高病毒載量樣本，耐藥檢測片段最好采用3次擴增產(chǎn)物進行混合，另外盡可能多挑取陽性克隆菌落提質(zhì)粒進行感染活性鑒定。本項目組將進一步優(yōu)化該檢測系統(tǒng)，以提高整體檢測效率。

利益沖突：無

本文引用格式：吳守麗, 劉峰, 顏蘋蘋, 等. 基于In-fusion技術(shù)的高通量HIV表型耐藥檢測系統(tǒng)的建立及應(yīng)用研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2019,35(4): 285-291. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.025