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Wnt/β-Catenin信號通路對氧化應(yīng)激損傷促進食管癌細胞凋亡的調(diào)控研究

2019-05-27 09:53:30劉振宇黃秀婷田曉娟鄒兵徐龍
關(guān)鍵詞:食管癌氧化應(yīng)激試劑盒

劉振宇,黃秀婷,田曉娟,鄒兵,徐龍*

(1.深圳大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科, 深圳 518033,2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院消化內(nèi)科, 深圳 518036)

病理狀態(tài)下,活性氧(ROS)可以在組織中大量產(chǎn)生并累積[1],積累的ROS可導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能障礙和DNA損傷[2,3],進而導(dǎo)致基因突變和細胞凋亡并形成氧化應(yīng)激損傷[4]。ROS還可以作為化學(xué)信使激活信號通路,從而影響細胞增殖,分化和凋亡。Wnt信號通路是一種進化上高度保守的信號通路,在動物胚胎生長、發(fā)育及組織再生等生理過程中發(fā)揮重要作用[5]。在腫瘤的形成過程中,Wnt信號通路參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,與腫瘤細胞的運動、增殖、凋亡、分化關(guān)系密切[6]。目前已有研究表明氧化應(yīng)激與Wnt信號通路相關(guān)[7,8],但是在食管癌中Wnt/β-Catenin信號通路參與氧化應(yīng)激損傷的分子機制尚未明確。本研究主要通過H2O2構(gòu)建食管癌細胞氧化應(yīng)激模型,并對其Wnt/β-Catenin信號通路的影響和機制進行探討。

1 材料和方法

1.1 材料

人食管癌細胞株TE-1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclone),胎牛血清(美國Hyclone),HBSS緩沖液(美國Gibco),青鏈霉素混合液(美國Gibco),胰蛋白酶消化液(美國Gibco),H2O2(國藥集團),臺盼藍染液(英濰捷基),過氧化氫酶試劑盒(CAT,南京建成),丙二醛試劑盒(MDA,南京建成),全蛋白提取試劑盒(南京凱基),蛋白上樣緩沖液(碧云天),SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天),BCA法蛋白定量試劑盒(賽默飛世爾),抗Bcl-2抗體(武漢三鷹),抗BAX抗體(武漢三鷹),抗Caspase-3抗體(Abcam),抗β-Catenin抗體(Abcam),抗Wnt5a抗體(CST),抗c-Myc抗體(CST),抗GAPDH抗體(武漢三鷹),HRP標記山羊抗兔(中杉金橋),HRP標記山羊抗小鼠(中杉金橋),蛋白Marker(賽默飛世爾)。

1.2 儀器

電熱恒溫水浴鍋(上海菁華),二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛世爾),臺式離心機(太倉華利達),Countess II(賽默飛世爾),超聲波細胞破碎儀(寧波新芝),電泳儀與轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國伯樂),分光光度計(上海精宏),酶標儀(賽默飛世爾)。

1.3 方法

1.3.1細胞培養(yǎng)及傳代 人食管癌細胞株TE-1培養(yǎng)于37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中,用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基中加入適當(dāng)比例100×青鏈霉素混合液,使青霉素、鏈霉素終濃度均為100 U/mL,根據(jù)細胞的生長情況更換培養(yǎng)液。細胞長至85%~95%匯合度時,用0.25%的胰蛋白酶消化細胞,待細胞將脫落時,全培養(yǎng)基終止消化反應(yīng),1 000 rpm離心5min,棄上清液,培養(yǎng)基重懸細胞。

1.3.2氧化應(yīng)激模型建立 75 cm2培養(yǎng)皿中接種5×107個細胞,細胞貼壁后分別加入終濃度為1、10、100 μmol/L H2O2處理TE-1細胞4h,構(gòu)建氧化應(yīng)激模型??瞻捉M中加入等量的無菌水作為對照。

1.3.3細胞凋亡檢測 分別取對照組、氧化應(yīng)激模型細胞和臺盼藍染液各10 μL,混合均勻,加入到細胞計數(shù)板小室中,插入Countess II,待系統(tǒng)穩(wěn)定后分別記錄細胞總數(shù)和凋亡細胞數(shù)。取3次獨立重復(fù)試驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。細胞凋亡率=(100×凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù))%

1.3.4MDA和CAT檢測 將對照組細胞和氧化應(yīng)激模型細胞用HBSS洗3遍,細胞刮刀刮下細胞,收集到離心管中。1 000 rpm離心5 min收集細胞,并于冰水浴中超聲裂解。按照試劑盒所提供的說明書,利用分光光度計檢測吸光度,計算細胞內(nèi)MDA和CAT的含量。

1.3.5Western blotting檢測相關(guān)蛋白的表達 采用Western blotting的方法檢測對照組和100 μmol/L組細胞中Bcl-2,Caspase-3,BAX,Wnt5a,β-Catenin,c-Myc的表達。HBSS緩沖液洗去多余培養(yǎng)基后,細胞刮刀刮下細胞,收集到EP管中。5 000 rpm離心去除多余緩沖液。按照蛋白提取試劑盒說明,加入適量蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑。冰水浴超聲1 min。10 000 rpm離心5 min后吸取上清,上清液為提取的總蛋白。利用BCA檢測試劑盒對蛋白定量。按照1:5比例將蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液混合,沸水浴中煮沸10 min,后插入冰中。按照凝膠配制試劑盒說明配置12%的聚丙烯酰胺凝膠。蛋白樣品每個泳道上樣80 μg。電泳結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。5%脫脂奶粉常溫封閉1 h。分別加入抗體,4℃孵育過夜,第2天恢復(fù)室溫后0.1%TBST搖床洗脫3次,每次10 min。按照1∶5 000比例加入二抗,室溫下孵育1 h。0.1%TBST搖床洗脫3次,每次10 min。膜上滴加ECL發(fā)光液,暗室中X光片曝光,顯影定影后攝片。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度H2O2處理對細胞凋亡率影響

隨著H2O2濃度的增加,對照組、1 μmol/L組、10 μmol/L組、100 μmol/L組的細胞凋亡率依次提高,分別為1.30%±0.67%、7.53%±1.23%、19.18%±1.91%、43.46%±1.60%,實驗組的細胞凋亡率高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 MDA和CAT含量的測定

不同濃度H2O2處理TE-1細胞4 h后,MDA和CAT的含量如表1所示,與對照組相比,細胞經(jīng)H2O2處理后MDA含量提高,CAT酶活力降低。表明H2O2誘導(dǎo)TE-1細胞氧化損傷。其中100 μmol/L組MDA含量最高,為80.77±8.43(P<0.01);100 μmol/L組CAT酶活力最低,為16.83±3.96(P<0.01);而1 μmol/L組與對照組相比,CAT酶活力無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2.3 相關(guān)蛋白表達的檢測

2.3.1氧化應(yīng)激對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 結(jié)果見圖1所示,100 μmol/L H2O2處理組和對照組相比Bcl-2蛋白表達水平明顯降低,而Caspase-3,Bax蛋白表達水平明顯提高(P<0.05)。

2.3.2氧化應(yīng)激對Wnt/β-Catenin信號通路的影響 結(jié)果見圖2所示,當(dāng)對TE-1細胞進行 H2O2處理4 h后,Wnt5a,β-Catenin,c-Myc的蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。

表1 對照組與實驗組 MDA和CAT含量的測定

注:與正常對照組相比,aP<0.05,bP<0.01。

圖1 H2O2處理對TE-1細胞凋亡的影響

圖2 H2O2處理對Wnt/β-Catenin信號通路的影響

3 討論

現(xiàn)已有報道指出,細胞代謝、輻射、化療藥物等因素均可導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生ROS并造成氧化應(yīng)激[9]。氧化應(yīng)激不僅可以引起腫瘤相關(guān)信號通路的異常,還會通過影響細胞的代謝活動促進腫瘤的進一步發(fā)展,因此了解氧化損傷對腫瘤細胞行為學(xué)改變以及相關(guān)機制的探討對腫瘤治療具有重要的意義。

在多種腫瘤細胞中,ROS水平處于異常狀態(tài)[9,10]。已有研究表明,食管癌細胞中具有較高的O2-,O2-可以在體內(nèi)反應(yīng)生成H2O2,ROS與腫瘤細胞凋亡關(guān)系密切[11,12]。我們的研究表明,當(dāng)使用H2O2誘導(dǎo)氧化損傷模型,食管癌TE-1細胞系的凋亡率與H2O2的濃度相關(guān),且當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時,MDA含量提高。MDA的產(chǎn)生是由于細胞膜中氧自由基對多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化所致,因此丙二醛水平越高,氧自由基水平越高,機體組織損傷則越嚴重[13]。CAT酶可以催化H2O2反應(yīng)生成水和氧。氧化損傷模型中,CAT酶活力降低意味著細胞清除活性氧自由基的能力降低,細胞易發(fā)生凋亡[14]。細胞凋亡往往通過Caspase依賴和非依賴途徑執(zhí)行,WB結(jié)果證明H2O2可以通過Caspase途徑誘導(dǎo)細胞凋亡,并使凋亡相關(guān)因子在蛋白水平上的表達發(fā)生變化。

Wnt信號通路分為經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路,其中β-Catenin依賴的Wnt信號通路是研究最深入,也是作用范圍最廣的。Wnt/β-Catenin信號通路參與腫瘤的增殖、凋亡、分化和細胞周期調(diào)控,β-Catenin作為這條通路里重要的轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)信號通路下游的多個靶基因而發(fā)揮調(diào)控作用。結(jié)果顯示,當(dāng)食管癌細胞受到氧化損傷時,Wnt5a、β-Catenin、c-Myc蛋白表達均下降。

綜上所述,H2O2可誘導(dǎo)食管癌TE-1細胞發(fā)生氧化應(yīng)激,造成細胞凋亡,機制可能與Wnt/β-Catenin信號通路受抑制相關(guān)。

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