羅陽蘭，鄧百萬，劉軍生，柏秋月，解修超，張毓文

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723001)

蕙蘭(Cymbidiumfaberi)為蘭科蕙蘭屬地生蘭，生于濕潤且排水良好的透光林地，廣泛分布于我國陜西南部、甘肅南部、浙江、四川、云南和西藏東部等地。蕙蘭是我國栽培最久和最普及的四大國蘭之一[1]，市場需求量大。而人為的過度采挖，加之該物種本身繁殖速度慢，生長周期長，使其難以滿足近年來日益增長的市場需求[2]。研究表明，內(nèi)生真菌可為蘭科植物的幼苗提供營養(yǎng)物質(zhì)和植物激素等[3-4]，有助于提高幼苗成活率，并促進(jìn)其生長發(fā)育[5-6]。如張晉彥等[7]利用篩選的4種內(nèi)生真菌通過固體菌劑和液體菌劑2種接種方式，建立了蘭花組培苗與真菌的共生培養(yǎng)體系，提高了幼苗的成活率。研究秦巴山區(qū)蕙蘭內(nèi)生真菌的多樣性，分離鑒定出更多內(nèi)生真菌，對開發(fā)利用秦巴山區(qū)蕙蘭內(nèi)生真菌資源，促進(jìn)蕙蘭生長發(fā)育具有重要意義。鑒于此，以陜西省略陽縣、洋縣和南鄭區(qū)3個(gè)地點(diǎn)采集的野生蕙蘭為試材，對其根部內(nèi)生真菌進(jìn)行分離鑒定，并分析內(nèi)生真菌多樣性，以期為秦巴山區(qū)蕙蘭內(nèi)生真菌資源的開發(fā)利用和資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年3—4月，對采集于陜西省漢中市略陽縣、南鄭區(qū)和洋縣3個(gè)地點(diǎn)的蕙蘭樣品(無病蟲害)進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。各試驗(yàn)樣地的環(huán)境條件見表1。

表1 各樣品采集地基本情況

1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硝酸鈉、硫酸亞鐵、蔗糖、瓊脂均為分析純，購自上海生工生物工程有限公司。

1.3 儀器

SW-CJ-1D型單人超凈工作臺(上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司)、YXQ-LS-50S型高壓滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、5404R型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf儀器公司)、GELDOC型凝膠成像儀(美國Bio-Rad有限公司)、K960型熱循環(huán)PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)。

1.4 培養(yǎng)基

改良PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L、硫酸鎂3 g/L、蕙蘭組織勻漿濾液(100 g/L)100 mL、瓊脂15 g/L、水900 mL，pH值自然。

察氏培養(yǎng)基(CA)：硝酸鈉3 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、硫酸鎂0. 5 g/L、硫酸亞鐵0. 01 g/L、蔗糖30 g/L、瓊脂15 g/L、水1 000 mL，pH值自然。

1.5 方法

1.5.1 內(nèi)生真菌的分離 將蕙蘭根組織用流水沖洗干凈，75%乙醇處理1 min，無菌水沖洗4次，0.1%升汞處理8 min，然后用2.5%次氯酸鈉消毒4 min，之后用無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干水分待用。將接入分離培養(yǎng)基的根組織用解剖刀切成1 cm長小段，每皿接種3塊組織塊，3個(gè)樣地共9個(gè)蕙蘭樣品各接種10皿，28 ℃恒溫箱培養(yǎng)，待菌絲長出，轉(zhuǎn)接入新培養(yǎng)皿。菌種保藏采用改良PDA 瓊脂斜面培養(yǎng)基，28 ℃恒溫箱培養(yǎng)，4 ℃冰箱保藏。

1.5.2 內(nèi)生真菌形態(tài)鑒定 在察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)，采用棉藍(lán)染色法[8]在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲體的形態(tài)和大小[9]，參考《真菌鑒定手冊》[10]對其進(jìn)行基本的分類鑒定。

1.5.3 內(nèi)生真菌ITS分子鑒定 利用CTAB法提取分離得到的內(nèi)生真菌菌株DNA，采用真菌通用引物ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL：2×TaqMaster Mix 25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，模板DNA 1 μL(質(zhì)量濃度10 ng/μL),ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s， 59 ℃退火30 s，72 ℃ 60 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果整理后進(jìn)行Blast比對，并提交NCBI申請獲得登錄號，利用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5.4 統(tǒng)計(jì)分析 利用分離率(Isolation rate，IR)[11]分析不同樣地蕙蘭內(nèi)生真菌的分布情況， IR=(樣本組織塊中分離的菌株數(shù)/全部供試樣本組織塊數(shù))×100%。

利用相對分離頻率(Relative frequency，RF)[12]衡量蕙蘭中某種內(nèi)生真菌的優(yōu)勢度，RF=(樣本中分離的某種內(nèi)生真菌的菌株數(shù)/分離的總菌株數(shù))×100%。

蕙蘭內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)和相似性系數(shù)計(jì)算方法如下：

香農(nóng)-維納指數(shù)(Shannon-Wiener index，H’)=-ΣPiln(Pi)，其中，Pi=Ni/N；

均勻度指數(shù)(Evenness index，E)=H’/lnS；

豐富度指數(shù)(Margalef index，M)=(S-1) /Log2(N)。

其中，Pi為內(nèi)生真菌i的菌株數(shù)占全部內(nèi)生真菌菌株數(shù)的百分?jǐn)?shù)，H’為內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)，S為每個(gè)樣地蕙蘭內(nèi)生真菌種類數(shù)，N為每個(gè)樣地蕙蘭內(nèi)生真菌總數(shù)。

辛普森指數(shù)(Simpson index，D)=1-Σ(Ni/N)2，Ni為每個(gè)樣地蕙蘭內(nèi)生真菌i的數(shù)量，N為每個(gè)樣地蕙蘭內(nèi)生真菌總數(shù)。

采用相似性系數(shù)(Sorenson similarity coefficient，Cs) 比較兩地蕙蘭樣品之間內(nèi)生真菌種類組成的相似程度，Cs=j/(a+b-j)。其中，j是兩地蕙蘭樣品之間共同具有的內(nèi)生真菌種類數(shù)，a是一地蕙蘭樣品中內(nèi)生真菌的種類數(shù)，b是另一地蕙蘭樣品中內(nèi)生真菌的種類數(shù)[12]。各樣地間的相似性系數(shù)在0.25以下，為極不相似；在0.25～0.50，為不相似，0.50以上為相似。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕙蘭內(nèi)生真菌的分離和鑒定結(jié)果

采用組織分離法從3個(gè)地點(diǎn)采集的9個(gè)蕙蘭樣品的270塊組織中共分離得到內(nèi)生真菌309株，其中，略陽縣共分離出102株，南鄭區(qū)共分離出93株，洋縣共分離出114株。

利用形態(tài)學(xué)方法根據(jù)菌落形態(tài)特征將分離到的菌株進(jìn)行初步排重、歸類后，共得到內(nèi)生真菌212株，其中，略陽縣88株，南鄭區(qū)64株，洋縣60株，分離得到的內(nèi)生真菌形態(tài)特征見表2。

表2 蕙蘭內(nèi)生真菌種類及形態(tài)學(xué)特征

續(xù)表2 蕙蘭內(nèi)生真菌種類及形態(tài)學(xué)特征

利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，以ITS1和ITS4為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到長度約800 bp的擴(kuò)增片段，經(jīng)測序后，提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行序列分析和相似性比較，取相似性大于99%的序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹以確定3個(gè)樣地所分離菌株的系統(tǒng)分類地位，如圖1—3所示，略陽縣分離得到的88株內(nèi)生真菌分屬于4個(gè)門9個(gè)綱25個(gè)屬；南鄭區(qū)的64株內(nèi)生真菌分屬于3個(gè)門8個(gè)綱20個(gè)屬；洋縣的60株內(nèi)生真菌分屬于4個(gè)門11個(gè)綱20個(gè)屬。

2.2 蕙蘭內(nèi)生真菌的種群組成及分布特征

龐雄飛等[13]研究認(rèn)為，某物種占整體物種的百分比即分離率分別體現(xiàn)了3種情況：優(yōu)勢屬≥10%，常見屬為1%～10%，稀有屬≤1%。由表3可知，蕙蘭內(nèi)生真菌中優(yōu)勢屬僅有1個(gè)，為木霉屬(Trichodermasp.)，其分離率和相對分離頻率分別為18.52%、23.58%。常見屬14個(gè)，其中，鐮刀菌屬(Fusariumsp.)分離率和相對分離頻率分別為8.89%、11.32%，青霉屬(Penicilliumsp.)分離率和相對分離頻率分別為6.67%、8.49%，曲霉屬(Aspergillussp.)分離率和相對分離頻率分別為5.56%、7.08%等。其余30個(gè)屬為稀有屬。此外，不同樣地的蕙蘭也有各自特有的內(nèi)生真菌菌屬，從略陽縣分離得到的內(nèi)生真菌有12個(gè)獨(dú)有屬，分別為亡革菌屬(Thanatephorussp.)、節(jié)菱孢屬(Arthriniumsp.)、叢赤殼屬(Nectriopsissp.)、Cephalothecasp.、Aphanoascussp.、Eladiasp.、小克銀漢霉屬(Cunninghamellasp.)、栓菌屬(Trametessp.)、棒孢屬(Corynesporasp.)、Trichaptumsp.、傘狀霉屬(Umbelopsissp.)和煙管菌屬(Bjerkanderasp.)；南鄭區(qū)有10個(gè)獨(dú)有屬，分別為擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsissp.)、Cadophorasp.、絲孢菌屬(Scedospoiumsp.)、毀絲霉屬(Myceliophthorasp.)、Microdiplodiasp.、Paraconiothyriumsp.、毛殼屬(Chaetomiumsp.)、瓶霉菌屬(Phialophorasp.)、粒毛盤菌屬(Lachnumsp.)和間座殼屬(Diaporthesp.)；洋縣有8個(gè)獨(dú)有屬，分別為炭角菌屬(Xylariasp.)、殼二孢屬(Ascochytasp.)、根霉屬(Rhizopussp.)、角擔(dān)菌屬(Ceratobasidiumsp.)、Acrocalymmasp.、革孔菌屬(Coriolopsissp.)、新赤殼屬(Neocosmosporasp.)和鬼傘屬(Coprinussp.)。

LY+數(shù)字表示略陽縣樣品所分離菌株的順序編號

2.3 蕙蘭內(nèi)生真菌的多樣性和相似性分析

由表4可知，不同樣地所分離的內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)不同，香農(nóng)-維納指數(shù)、均勻度指數(shù)、辛普森指數(shù)大小順序均為略陽縣>洋縣>南鄭區(qū)，豐富度指數(shù)、分離率、相對分離頻率大小順序均為略陽縣>南鄭區(qū)>洋縣。由此可見，略陽縣采集的蕙蘭內(nèi)生真菌多樣性程度高，生境條件適宜，群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。相關(guān)性分析結(jié)果表明，香農(nóng)-維納指數(shù)分別與均勻度指數(shù)、辛普森指數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系。香農(nóng)-維納指數(shù)與均勻度指數(shù)之間的回歸方程為y=0.118 8x+0.529 7，決定系數(shù)(R2)=0.592 4；香農(nóng)-維納指數(shù)與豐富度指數(shù)之間的回歸方程為y=0.204 7x+0.353 7，R2=0.900 8。豐富度指數(shù)與分離率和相對分離頻率呈顯著正相關(guān)關(guān)系，豐富度指數(shù)與相對分離率之間的回歸方程為y=47.075x-77.442，R2=0.998 6；豐富度指數(shù)與相對分離頻率之間的回歸方程為y=19.962x-32.808，R2=0.998 8。

NZ+數(shù)字表示南鄭區(qū)樣品所分離菌株的順序編號

由表5可知，3個(gè)樣地間，略陽縣與南鄭區(qū)，南鄭區(qū)與洋縣間的蕙蘭內(nèi)生真菌組成不相似，而略陽縣和洋縣間的內(nèi)生真菌組成相似。

LG+數(shù)字表示洋縣樣品所分離菌株的順序編號

門Phylum屬Genus數(shù)量/個(gè) Number略陽縣Lueyang南鄭區(qū)Nanzheng洋縣Yangxian總數(shù)Total分離率/%Isolation rate相對分離頻率/%Relative frequency子囊菌門Ascomycota肉座菌屬(Hypocrea sp.)21693.334.25青霉屬(Penicillium sp.)963186.678.49曲霉屬(Aspergillus sp.)636155.567.08節(jié)菱孢屬(Arthrinium sp.)10010.370.47赤霉菌屬(Gibberella sp.)10120.740.94叢赤殼屬(Nectriopsis sp.)40041.481.89生赤殼屬(Bionectria sp.)11020.740.94毛殼屬(Chaetomium sp.)04041.481.89瓶霉菌屬(Phialophora sp.)02020.740.94粒毛盤菌屬(Lachnum sp.)01010.370.47炭團(tuán)菌屬(Hypoxylon sp.)02241.481.89間座殼屬(Diaporthe sp.)01010.370.47炭角菌屬(Xylaria sp.)00331.111.42

表4 3個(gè)樣地蕙蘭內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從秦巴山區(qū)3個(gè)樣地采集的蕙蘭中共分離出212株內(nèi)生真菌，分屬于4個(gè)門45個(gè)屬，其中，木霉屬的分離率和相對分離頻率最高，分別為18.52%、23.58%，為優(yōu)勢內(nèi)生真菌類群。另外還有14個(gè)常見屬和30個(gè)稀有屬，這可能是因?yàn)橄∮袑僬婢谵ヌm內(nèi)部分布頻率較低，或者培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件不適宜其生長，也可能是菌株本身即為稀有屬[14]，如瓶霉菌屬(Phialophorasp.)、傘狀霉屬(Umbelopsissp.)、附毛孔菌屬(Trichaptumsp.)[15]等。

多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明，略陽縣采集的蕙蘭內(nèi)生真菌多樣性程度高，生境條件適宜，群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，其植株長勢也較好，可對其生長環(huán)境條件如土壤理化性質(zhì)、養(yǎng)分含量和酶活力等進(jìn)一步研究，探索適宜蕙蘭生長的環(huán)境條件，為人工栽培蕙蘭提供借鑒。相似性分析結(jié)果表明，洋縣蕙蘭與略陽縣蕙蘭之間內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)相似，這可能是由于兩地同屬于秦嶺山系，海拔、降水和土壤理化性質(zhì)等趨于一致，而南鄭區(qū)采樣點(diǎn)位于巴山山系，與這兩地的蕙蘭樣品中內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)不相似，這與SAKAMOTO等[16]認(rèn)為蘭科內(nèi)生真菌種類與其所處地理位置具有較大的相關(guān)性的觀點(diǎn)相一致。王倩[17]研究發(fā)現(xiàn)，浙江天目山、重慶金佛山的蕙蘭與膠膜菌屬真菌共生，河南信陽的蕙蘭與臘殼菌屬(Sebacinasp.)菌根真菌共生，而本研究分離的內(nèi)生真菌中包含角擔(dān)菌屬和亡革菌屬2個(gè)菌根真菌屬的真菌，表明秦嶺蕙蘭與角擔(dān)菌屬和亡革菌屬菌根真菌共生，這說明蘭屬植物與菌根真菌的共生存在地域多樣性，并不是專一與膠膜菌屬共生。

植物內(nèi)生菌是一類重要的微生物資源，在促進(jìn)植物生長、提高植物抗逆性[18]、加強(qiáng)生物防治[19]、生產(chǎn)活性次生代謝產(chǎn)物[20]和修復(fù)環(huán)境污染[21]等方面發(fā)揮了重要作用。本研究分離鑒定的內(nèi)生真菌中有多種類群與已報(bào)道的具有應(yīng)用價(jià)值的真菌為同一菌屬。楊秀麗等[22]認(rèn)為，瓶霉菌屬(Phialophorasp.)真菌是一類具有廣譜性的內(nèi)生真菌，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。木霉屬(Trichodermasp.)和粘帚霉屬(Gliocladiumsp.)真菌均有促進(jìn)植物生長、防治植物病害等作用[23-24]，小克銀漢霉屬真菌可對甘草次酸、青蒿素、雷諾嗪等藥物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化[25-27]。本試驗(yàn)分離的蕙蘭內(nèi)生真菌應(yīng)用潛力巨大，具有進(jìn)一步開發(fā)利用的價(jià)值。本試驗(yàn)通過分離鑒定秦巴山區(qū)蕙蘭內(nèi)生真菌并對其進(jìn)行多樣性分析，了解蕙蘭內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)，后續(xù)試驗(yàn)將篩選能夠促進(jìn)蕙蘭生長、提高蕙蘭抗逆性的真菌菌株，這對于開發(fā)具有生防作用的菌劑或菌肥具有重要意義，可為蕙蘭內(nèi)生真菌資源的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。