任文萍 邱 堃 李莉娟 吳志新 袁軍法

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070; 2. 武漢市第一醫(yī)院病理科, 武漢 430022;3. 湖北省水生動(dòng)物病害防控工程技術(shù)中心, 武漢 430070)

腫瘤是機(jī)體在各種致瘤因素作用下, 局部組織的細(xì)胞基因調(diào)控失常, 導(dǎo)致克隆性異常增生而形成的局部腫塊, 是當(dāng)前人類健康的主要威脅之一[1]。良性腫瘤對(duì)器官、組織只有擠壓和阻塞作用, 易被清除干凈, 一般不轉(zhuǎn)移、不復(fù)發(fā)。惡性腫瘤能破壞組織、器官的結(jié)構(gòu)和功能, 引起壞死、出血及感染等, 并通過(guò)血液及淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移形成轉(zhuǎn)移灶, 導(dǎo)致多臟器的損害[2]。與高等脊椎動(dòng)物類似, 魚類也發(fā)現(xiàn)了多種腫瘤。盡管魚類腫瘤在養(yǎng)殖中的危害較輕, 但作為腫瘤研究的工具, 已成為人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等機(jī)理研究以及抗癌藥物篩選不可或缺的模型。魚類腫瘤還作為環(huán)境指示物在致癌物鑒定等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

至今, 已記錄的魚類腫瘤包括174例, 分屬于35種, 包括乳頭狀腫瘤、神經(jīng)胚胎瘤、腎胚胎瘤、黑色素瘤、纖維瘤、性腺腫瘤等, 其中皮膚瘤報(bào)道最多, 而性腺腫瘤較少[3—5]。魚類性腺腫瘤的報(bào)道僅有12例, 分別發(fā)生在鯉科、肺魚科、太陽(yáng)魚科和鮨科等4科7種[3—6]。魚類性腺腫瘤主要有以下三類: 一是自發(fā)性的性腺基質(zhì)腫瘤, 如支持細(xì)胞腫瘤,僅在鯉科魚類中發(fā)現(xiàn)[6]; 二是間質(zhì)細(xì)胞性腺腫瘤, 如平滑肌瘤和纖維肌瘤, 在黃鱸、大口黑鱸和非洲肺魚等魚中發(fā)現(xiàn)[7—9]; 三是生殖細(xì)胞腫瘤, 如典型精原細(xì)胞瘤和精母細(xì)胞型精原細(xì)胞瘤, 已在鯉科、肺魚科魚類中發(fā)現(xiàn)[6,10,11]。

精原細(xì)胞瘤也稱生殖細(xì)胞癌, 在生殖細(xì)胞腫瘤中約占60%, 高發(fā)于雄性動(dòng)物[4]。典型精原細(xì)胞瘤原發(fā)于生殖腺, 在睪丸處較常見(jiàn), 也可見(jiàn)于后腹膜、前列腺、肺、胸腺、外耳道等部位。精母細(xì)胞型精原細(xì)胞瘤約占生殖細(xì)胞腫瘤的4%—7%, 常發(fā)于年齡較大的雄性, 一般不發(fā)生轉(zhuǎn)移, 但具有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的精母細(xì)胞型精原細(xì)胞瘤較罕見(jiàn)[12]。本病的病因尚不明確, 可能與遺傳、隱睪、內(nèi)分泌、外傷有關(guān), 此外病毒性疾病和細(xì)菌性感染也可間接引發(fā)性腺腫瘤。魚類的精原細(xì)胞瘤分別在金魚和鱸中發(fā)現(xiàn), 并已建立斑馬魚模型[13—15],但精母細(xì)胞型精原細(xì)胞瘤魚類模型尚未建立。

本研究報(bào)道了一例銀鯽(Carassius gibelio)自發(fā)性精母細(xì)胞型精原細(xì)胞瘤, 詳細(xì)描述了其病理特征及其主要細(xì)胞類型, 系在低等脊椎動(dòng)物中首次發(fā)現(xiàn)具有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的精母細(xì)胞型精原細(xì)胞瘤, 豐富了魚類性腺腫瘤的研究資料, 也為構(gòu)建人類精母細(xì)胞型精原細(xì)胞瘤動(dòng)物模型提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

銀鯽采集自某湖泊, 經(jīng)充氧運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室, 用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)。解剖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)一例患腫瘤的銀鯽,分離腫瘤組織后用于后續(xù)的分析。

1.2 組織切片制備及HE染色

將摘除的腫瘤組織, 切成0.5 cm×0.5 cm小塊,4%多聚甲醛固定24h。石蠟包埋后, 連續(xù)切片(制備組織3 μm切片)。烘干后依次經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明, HE染色封片[16]。按相同方法取健康鯽的精巢制片, 在OLYMPUS CX21顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 超薄切片制備與觀察

自摘除的腫瘤組織, 切成3 mm×3 mm小塊, 以戊二醛固定48h, 超薄切片由中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所協(xié)助完成, 制備的切片在200 KV透射電鏡下(TECNAL, FEI)觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

宏觀上, 魚體明顯消瘦, 腹部腫大, 觸摸有硬塊,鱗片和鰭均正常。解剖發(fā)現(xiàn)該魚體內(nèi)腹腔后部緊鄰泄殖孔處有一被膜完整的實(shí)質(zhì)腫塊, 呈淡黃色,大小為3 cm×2 cm×1.5 cm (圖1a)。腫塊橫切面堅(jiān)實(shí), 質(zhì)地均勻。對(duì)腫塊的邊界檢查證實(shí)了它們的限制性, 未見(jiàn)向鄰近組織如腸壁、肝胰臟、脾臟、腎臟和鰾浸潤(rùn)(圖1b)。

圖1 腫瘤組織在體觀察Fig. 1 Tumor tissue in the body

2.2 組織結(jié)構(gòu)觀察

腫瘤組織經(jīng)制備石蠟切片后HE染色, 顯微觀察顯示, 腫瘤組織表現(xiàn)擴(kuò)張性生長(zhǎng)和血管增生, 腫瘤間質(zhì)組織彌漫排列, 腫瘤細(xì)胞排列較密, 幾乎充滿整個(gè)精小巢(圖2a)。瘤細(xì)胞大小不一, 主要包括大、中、小三種細(xì)胞類型, 形狀為圓形或橢圓形。細(xì)胞核位于中央, 核呈圓形或橢圓形, 可見(jiàn)小的核仁, 有的胞漿呈現(xiàn)空泡狀。部分區(qū)域有裂隙, 裂隙邊緣被覆腫瘤細(xì)胞(圖2b)。腫瘤間質(zhì)組織呈高度細(xì)胞性和彌散性, 缺乏間質(zhì)細(xì)胞, 主要由纖維成分組成, 其中小血管較為常見(jiàn)(圖2a、2b)。腫瘤組織中可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn), 表現(xiàn)為輕度的炎癥反應(yīng)。對(duì)比正常的精巢結(jié)構(gòu)(圖2c、2d), 其為多細(xì)胞巢, 結(jié)締組織伸入精巢內(nèi)部形成許多隔膜, 具有明顯的小葉結(jié)構(gòu)特征。

2.3 超微結(jié)構(gòu)觀察

透射電鏡觀察顯示: 腫瘤組織中初級(jí)精母細(xì)胞(SC1)是主要的細(xì)胞類型, 次級(jí)精母細(xì)胞(SC2)比初級(jí)精母細(xì)胞(SC1)小, 但形態(tài)相似。精母細(xì)胞之間缺乏橋粒特征(圖3a—c)。該腫瘤組織最顯著的特征是大部分細(xì)胞停留在精母細(xì)胞階段(圖3a、3b),且精細(xì)胞凋亡(圖3c)。精細(xì)胞(SD)在精子發(fā)生完成之前釋放包含在巢中, 缺乏支撐細(xì)胞連接(圖3e、3f), 其中一些精細(xì)胞凋亡和變性(圖4a、4b)。間質(zhì)組織含有很少的支撐細(xì)胞, 這些支撐細(xì)胞位于生精小葉的周邊, 與基膜接觸(圖4c)。間質(zhì)組織中含有電子致密脂滴, 部分空泡化(圖4d)。另外細(xì)胞質(zhì)含有大量的游離核糖體和少量的膜結(jié)合顆粒(圖4e)?；诎l(fā)現(xiàn)未分化的生殖細(xì)胞和少量的有絲分裂(圖4d—f), 據(jù)此將該腫瘤病變分類為精母細(xì)胞型精原細(xì)胞瘤。

3 討論

2016年世界衛(wèi)生組織對(duì)人類和哺乳動(dòng)物睪丸腫瘤進(jìn)行了新分類, 根據(jù)臨床病例特點(diǎn)將睪丸腫瘤分為兩個(gè)亞型, 精母細(xì)胞腫瘤和精原細(xì)胞瘤[17]。精原細(xì)胞瘤主要發(fā)生在睪丸及性腺外, 伴隨其他生殖細(xì)胞腫瘤, 細(xì)胞類型單一且纖維性間質(zhì)顯著; 精母細(xì)胞瘤主要發(fā)生于睪丸, 不伴隨其他類型的生殖細(xì)胞瘤, 細(xì)胞類型有大、中、小三種細(xì)胞且纖維性間質(zhì)稀少。Masahito等[11]報(bào)道的人精母細(xì)胞瘤主要由大細(xì)胞、中等細(xì)胞、小細(xì)胞構(gòu)成, 缺乏糖原及肉芽腫反應(yīng)、間質(zhì)少, 腫瘤細(xì)胞形態(tài)類似于初級(jí)精母細(xì)胞。在本研究中銀鯽的腫瘤組織中有含大量的未完全成型精細(xì)胞, 且存在精子的尾管結(jié)構(gòu), 排除了肝癌、腸癌等其他腫瘤的干擾, 證實(shí)為精原細(xì)胞瘤。超微結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn), 腫瘤組織內(nèi)的細(xì)胞主要包括大細(xì)胞、中等細(xì)胞和小細(xì)胞構(gòu)成, 支撐細(xì)胞稀少,與人類和哺乳動(dòng)物的精母細(xì)胞瘤一致, 因此將該性腺腫瘤定義為精母細(xì)胞型精原細(xì)胞瘤。

同已報(bào)道的魚類精原細(xì)胞瘤比較, 本研究描述的銀鯽精原細(xì)胞瘤具有不同發(fā)育階段的精母細(xì)胞,且可維持精子的正常發(fā)育階段, 與Nigrelli和Jakowska[18]和Masahito等[11]所描述的精母細(xì)胞型精原細(xì)胞瘤一致, 但這些腫瘤組織不具有淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。我們?cè)诒纠?xì)胞瘤組織中還觀察到較少的有絲分裂現(xiàn)象和稀少的支撐細(xì)胞, 并有少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn), 這與Hubbard和Fletcher[10]中所描述的病理特征差別較大, 該精原細(xì)胞瘤由分化較好的大腫瘤細(xì)胞群組成, 有絲分裂率高, 沒(méi)有明顯的炎癥和壞死。Hawkins 等[19]和Smolowitz 等[13]描述的精原細(xì)胞瘤病理特征是具有被豐富的纖維結(jié)締組織分隔小葉模式, 精子細(xì)胞聚集, 具有低有絲分裂率的腫瘤細(xì)胞, 而本例精母型精原細(xì)胞瘤具有高度細(xì)胞性和彌散的結(jié)締組織, 缺乏明顯的小葉結(jié)構(gòu)。

圖2 精母細(xì)胞型精原細(xì)胞瘤的組織結(jié)構(gòu)(HE)Fig. 2 Histological structure of spermatocytic seminoma

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的家畜生殖系統(tǒng)腫瘤國(guó)際組織學(xué)分類, 精原細(xì)胞瘤可分為內(nèi)瘤型和彌漫型2種生長(zhǎng)模式[20]。本例腫瘤的顯著特點(diǎn)為腫瘤細(xì)胞彌漫分布, 大小不一, 支持細(xì)胞少, 未侵入其他組織。腫瘤細(xì)胞的小葉排列和由淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的基質(zhì)成分, 表明本例精原細(xì)胞瘤為彌漫型。魚類的性腺腫瘤一般表現(xiàn)為低度惡性, 具有低度分化的腫瘤細(xì)胞,腫瘤組織有高度的胞核細(xì)胞和異核細(xì)胞, 有的案例腫瘤組織侵犯臨近組織, 有的案例腫瘤組織被完整的包膜包裹, 不浸潤(rùn)臨近器官。在人類和其他哺乳動(dòng)物中, 睪丸生殖細(xì)胞來(lái)源的多數(shù)精原細(xì)胞瘤也為低度惡性腫瘤, 如犬睪丸精原細(xì)胞瘤[21]。本研究報(bào)道的精母細(xì)胞型精原細(xì)胞瘤, 宏觀上具包膜包被、實(shí)質(zhì), 呈擴(kuò)大性生長(zhǎng), 壓迫腸道和肝臟組織, 生殖腺可辨認(rèn), 推斷該精原細(xì)胞瘤起源于非正常位置。

魚類腫瘤作為腫瘤學(xué)研究的工具已取得較大進(jìn)展。新月魚和劍尾魚的雜交一代自發(fā)產(chǎn)生的黑色素瘤已經(jīng)成為研究腫瘤形成的重要模型[22]; 雙色雀鯛中由神經(jīng)纖維瘤和色素細(xì)胞瘤組成的多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤疾病, 已作為人類罕見(jiàn)的多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤 1型疾病的研究模型[23], 且已經(jīng)成功建立虹鱒肝細(xì)胞瘤和腎母細(xì)胞瘤模型、金魚肝腫瘤和神經(jīng)鞘瘤模型、鲴乳頭狀瘤模型、白斑狗魚淋巴瘤模型等[24]。魚類精原細(xì)胞瘤與哺乳動(dòng)物的精原細(xì)胞瘤在形態(tài)結(jié)構(gòu)上具有一致性。Sirri等[6]的腫瘤免疫組化表型也證明了人類、哺乳動(dòng)物和魚類性腺腫瘤的相似性。目前, 針對(duì)于精母型精原細(xì)胞瘤的研究較少, 本病例的發(fā)現(xiàn)為建立此腫瘤的魚類模型提供了參考。

盡管誘發(fā)腫瘤的因素復(fù)雜, 但環(huán)境因素是最為重要的誘因之一[3]。1975年, Gennady等[25]用N-2-氟乙烯乙酰胺、O-氨基偶氮甲苯、4-二甲氨基偶氮苯、二乙基亞硝胺和二甲基亞硝胺等成功誘導(dǎo)了水族箱中孔雀魚和斑馬魚的膽管瘤、肝腺瘤、膽管癌和肝細(xì)胞癌等, 證明了魚類是檢測(cè)致癌化合物和篩選環(huán)境致癌物質(zhì)的合適模型。陳玉漢等[26]1966—1971年的流行病學(xué)調(diào)查顯示魚類精原細(xì)胞瘤五年平均檢出率為10.8%, 類似現(xiàn)象在西班牙塔古斯河、水庫(kù)和盆地中也觀察到[27,28]。而Down和Leatherland[29]發(fā)現(xiàn)魚類腫瘤在工業(yè)污染較嚴(yán)重或者是相對(duì)不受工業(yè)污染的地區(qū)都有存在。因此, 通過(guò)監(jiān)測(cè)水體內(nèi)魚類的腫瘤檢出率, 能否作為環(huán)境致癌物的評(píng)估指標(biāo)尚需更全面的調(diào)查。

圖3 精母細(xì)胞型精原細(xì)胞瘤的超微結(jié)構(gòu)Fig. 3 Ultrastructure of spermatocytic seminoma

圖4 精母細(xì)胞型精原細(xì)胞瘤的超微結(jié)構(gòu)Fig. 4 Ultrastructure of spermatocytic seminoma