張紅波 董聰聰 楊燕君 付君珂 劉 黎 賀新宇 施軍瓊 吳忠興

(西南大學三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室, 重慶市三峽庫區(qū)植物生態(tài)與資源重點實驗室, 重慶 400715)

抗生素是一種天然和半合成的化合物, 可以抑制或消除微生物(例如細菌、真菌或原生動物)的生長[1]。隨著農業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 抗生素在現(xiàn)代農業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等中都發(fā)揮著重要作用[2]。然而, 由于抗生素的大量使用, 過期抗生素藥品處理不當及含抗生素污水處理不完全等原因, 導致大量抗生素藥物不斷地排放到水環(huán)境中, 其對環(huán)境安全、生態(tài)系統(tǒng)及人類健康的威脅越來越嚴重[3,4]。有報道, 目前水中檢測到的抗生素有50余種, 不同的抗生素在水中的殘留量從ng/L到μg/L不等[5,6]。Wei等[6]調查研究發(fā)現(xiàn)江蘇省大型禽畜養(yǎng)殖場廢水中磺胺甲嘧啶、氧四環(huán)素、四環(huán)素和磺胺甲惡唑檢測到的最大濃度分別為211、72.9、10.3和 63.6 μg/L。因此, 抗生素已被認為是一類新興的環(huán)境污染物[7]。

鏈霉素是從灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)分離的氨基糖苷類物質, 通過干擾氨酰-tRNA與核糖體的結合, 導致遺傳密碼錯讀, 抑制mRNA翻譯起始和異常校對的一類抗生素[8]。因此, 其被廣泛用于人類和獸醫(yī)學的預防和治療, 并作為植物檢疫劑[9]。在美國, 鏈霉素被廣泛應用于控制水果、蔬菜、種子、普通作物以及觀賞作物的細菌和真菌疾病, 并作為觀賞池塘和水族館微藻生長的殺菌、抑菌的抗生素[10]。沈洪艷等[11]發(fā)現(xiàn)鏈霉素暴露對錦鯉魚體會造成暫時性損傷, 但最終會恢復到正常水平。王麗新[12]研究表明SOD、GSH、GSH-PX和MDA可作為評估鏈霉素廢水對于斑馬魚污染脅迫的敏感生物標志物。

浮游植物是水生環(huán)境中營養(yǎng)鏈中的第一個環(huán)節(jié), 其生長、組成的變化將影響水生生態(tài)系統(tǒng)[13]。張磊等[14]研究表明, 鏈霉素明顯抑制了蛋白核小球藻的光合放氧, 對藻細胞產(chǎn)氫后期的生長也有一定抑制作用。Qian等[13]研究表明銅綠微囊藻對鏈霉素比小球藻更敏感。然而, 這些研究主要探討鏈霉素對藻類的生長及抗氧化酶活性的影響, 卻很少從光合角度去關注其毒性效應的機制。Strasser和Strasser[15]在基于生物膜能量流動基礎上建立了針對快速葉綠素熒光誘導曲線的數(shù)據(jù)分析和處理方法-JIP-測定(JIP-test), 為深入研究光合作用原初反應提供了有力而便捷的工具。

念珠藻(Nostoc)屬于藍藻門、念珠藻目、念珠藻科、念珠藻屬。其分布范圍很廣, 陸地和水中均有分布, 是一種水體常見的、廣譜性的代表種類。由于其獲取容易, 且分布范圍廣泛, 所以念珠藻是一種研究毒素生態(tài)效應的理想材料。因此, 為了探討鏈霉素對藻類毒性效應機制, 本研究以利用Handy-PEA分析了不同鏈霉素濃度培養(yǎng)下念珠藻的生長及光合系統(tǒng)葉綠素熒光特性, 旨在從光合角度去揭示鏈霉素對藻類的毒性效應, 并為探討抗生素對水生生態(tài)系統(tǒng)影響提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)

念珠藻(Nostocsp. FACHB-95)由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供。在藻種置光照培養(yǎng)箱中, 以MA培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)[16], 培養(yǎng)溫度(25±0.1)℃, 光照為36 μmol/(m2·s)、光暗比為12h∶12h。

1.2 實驗設計

將培養(yǎng)至指數(shù)生長期藻種離心后, 分別接入含有250 mL的錐形瓶中, 接種OD為0.115左右。以滅菌后的MA培養(yǎng)基配置鏈霉素(純度大于99%, 生工生物工程(上海)股份有限公司)母液, 然后參考環(huán)境當中抗生素含量及前期預實驗, 將培養(yǎng)基配制成0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/L的5個濃度。每個濃度組設置3個重復, 以不含鏈霉素的MA培養(yǎng)基作為空白對照。培養(yǎng)條件與藻種培養(yǎng)相同, 每天定時搖動3次, 使藻細胞充分與培養(yǎng)液接觸。

1.3 葉綠素a及EC50測定

葉綠素a的測定采用90%丙酮于黑暗中抽提24h, 離心后的上清液通過分光光度度計測定630、647、664和750的吸收值[17]。比生長速率的計算參照xiang等的方法[18], 96h半致死濃度(96h-EC50)采用概率單位法(Probit method)進行計算[19]。

1.4 葉綠素熒光動力學曲線及葉綠素熒光參數(shù)

取2 mL藻液, 置黑暗處適應25min后, 用便攜式植物效率分析儀(Handy-PEA, 英國漢莎公司)測定不同濃度鏈霉素處理后的念珠藻多相葉綠素熒光變化。測定時光化光為3000 μmol quanta/(m2.s), 收集10μs至2s的熒光信息。并通過JIP-測定獲得相關熒光參數(shù)(表1)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用Excel進行處理, 使用SPSS 22對所有數(shù)據(jù)均進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。當P＜0.05, 差異顯著性,P＜0.01, 差異極顯著性。所有圖形均用Origin 8.6進行。

2 結果

2.1 葉綠素含量、比生長速率及EC50值

在0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/L濃度的鏈霉素處理下培養(yǎng)至96h, 葉綠素含量與對照組相比分別下降了23.79%、42.80%、71.15%、80.99%和80.23%, 且與對照組均有極顯著差異(P＜0.01, 圖1A)。比生長速率隨鏈霉素濃度升高而下降, 當鏈霉素濃度高于為0.05 mg/L時, 比生長速率被顯著抑制(P＜0.05), 當鏈霉素濃度大于0.1 mg/L時, 念珠藻生長完全被抑制, 比生長速率為負值(圖1B)。通過SPSS計算得到念珠藻暴露于鏈霉素中96h的EC50值(96h-EC50)為(0.13±0.037) mg/L。

2.2 葉綠素熒光動力學曲線

在不同濃度的鏈霉素處理后, 各濃度下念珠藻的熒光動力學曲線如圖2。低濃度(≤0.1 mg/L)的相對熒光動力學曲線與對照組無顯著差異。而當濃度高于0.1 mg/L的相對熒光曲線發(fā)生了顯著的變化, J點消失, 并出現(xiàn)了明顯的K點, K點的相對熒光值隨鏈霉素濃度的升高的增大。

2.3 葉綠素熒光動力學參數(shù)(JIP-test)

可變熒光(Fv)、光系統(tǒng)Ⅱ(SPⅡ)的潛在活性(Fv/F0)、光系統(tǒng)Ⅱ(SPⅡ)最大光化學效率(φP0)、用于電子傳遞的量子產(chǎn)額(φE0)、以吸收光能為基礎的性能指數(shù)(PIabs)和單位面積上有活性的反應中心的數(shù)目(RC/CS0)均隨鏈霉素濃度的升高而顯著下降, 且與對照組均呈現(xiàn)出極顯著的差異(P＜0.01,圖3A、3B)。然而, 單位葉綠素最大熒光產(chǎn)量(Fm/Chl.a)、單位反應中心吸收的光能(ABS/RC)和反應中心的熱耗散(DI0/RC)均隨鏈霉素濃度的升高而增加, 當鏈霉素濃度大于0.1 mg/L時, 與對照組有極顯著的差異(P＞0.01, 圖3B)。

圖1 不同鏈霉素濃度處理下念珠藻的葉綠素含量(A)和比生長速率(B)Fig. 1 The effects of different concentrations of streptomycin on chlorophyll a content (A) and the growth rate (B) of Nostoc.

圖2 念珠藻快速葉綠素熒光動力學曲線Fig. 2 The fast fluorescence transient curve of Nostoc

3 討論

3.1 鏈霉素對念珠藻生長及葉綠素a的影響

抗生素作為常用的藥物之一, 由于大量的使用,導致其不斷地進入水體環(huán)境中, 造成了極大的環(huán)境生態(tài)風險[21]。先前研究表明, 銅綠微囊藻和小球藻暴露在鏈霉素中96h后的EC50分別為0.28和20.08 mg/L[13]。本研究表明在鏈霉素處理96h時, 念珠藻EC50值為(0.13±0.037) mg/L, 與藍藻銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)差異不大, 比綠藻小球藻(Chlorella pyrenoidosa)更加敏感。Freyssinet[22]發(fā)現(xiàn)鏈霉素主要與葉綠體核糖體結合, 而與細胞質核糖體結合很少, 進而影響蛋白質進入葉綠體的合成。本文研究發(fā)現(xiàn), 在各鏈霉素濃度培養(yǎng)96h, 葉綠素a含量與對照組相比明顯下降(圖1A), 然而單位細胞葉綠素含量并未表現(xiàn)出顯著的差異。Reid等[23]發(fā)現(xiàn)小球藻暴露于鏈霉素中, 引起的生長減少是由于小球藻二氧化碳固定受到抑制, 導致生長降低。本研究也發(fā)現(xiàn)在鏈霉素處理后, 念珠藻生長受到顯著的抑制, 表明鏈霉素未通過抑制念珠藻葉綠素a的合成導致其生長受到抑制。

3.2 鏈霉素對念珠藻熒光動力學曲線的影響

Bj?rkman[24]研究表明葉綠素含量的減少反映了光反應中心復合體天線色素減少, 暗示在鏈霉素處理后, 念珠藻的光系統(tǒng)可能發(fā)生損傷。本研究發(fā)現(xiàn)低濃度(≤0.1 mg/L)處理, 念珠藻相對熒光動力學曲線與對照組幾乎無顯著差異, 而濃度高于0.1 mg/L時相對熒光曲線出現(xiàn)了明顯的K點(圖2)。研究表明, 當PSⅡ的供體側受到脅迫時, 在極短的時間內(在J點之前), 葉綠素熒光產(chǎn)量就會上升, 出現(xiàn)K點(光照后大約300 μs處的特征位點)[20,25]。K點的出現(xiàn)是由于水裂解系統(tǒng)受到抑制和QA之前的受體側部分被抑制所造成, 導致了放氧復合體(OEC)受到損害, 因此放氧復合體往往被作為OEC被傷害的一個特殊標記[26,27]。念珠藻在高濃度鏈霉素處理后出現(xiàn)了明顯的K點, 表明在鏈霉素處理后念珠藻PSⅡ受體側受到傷害, 導致了OEC損傷發(fā)生。

圖3 在不同鏈霉素處理下念珠藻的熒光參數(shù)與對照組的百分比Fig. 3 The effects of streptomycin to the fluorescence parameters of Nostoc

3.3 鏈霉素對念珠藻光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)熒光動力學參數(shù)的影響

PSⅡ反應中心結構的改變, 導致不參與電子傳遞的封閉反應中心的數(shù)量增加, 進而導致了Fv的降低[28]。因此,Fv的降低通常被認為是光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)供體側的電子傳遞被抑制的一種表征[29]。本研究發(fā)現(xiàn)Fv隨著鏈霉素的增加和降低(圖3A), 進一步表明了念珠藻的供體側電子傳遞被抑制, 這也可能與復合天線中葉綠素濃度的降低或放氧發(fā)生復合物活性的降低有關[30]。在正常條件下, 有活性的PSⅡ反應中心將捕獲的光能轉化為激發(fā)能, 并將其中的一部分轉化為化學能, 推動碳同化反應, 其余部分耗散掉。然而, 在某些脅迫下, 光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應中心發(fā)生可能部分失活, 能吸收光能但不能推動電子傳遞[27]。本研究發(fā)現(xiàn), 單位面積上有活性反應中心(RC/CS0)在鏈霉素處理后顯著低于對照組(圖3B), 說明鏈霉素導致了念珠藻光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應中心失活或降解。PIabs在一定程度上反映了脅迫對光合結構的破壞[20]。研究已表明高等植物在受到某些脅迫時, 光合機構被破壞,PIabs會顯著下降[20,31,32]。在本研究中, 隨著培養(yǎng)基中鏈霉素濃度的增加, 吸收性能指標(PIabs)顯著降低(P＜0.05), 且高濃度(≥0.2 mg/L)的PIabs為0(圖3B), 表明念珠藻的光合機構受到極大破壞, 光合效率大幅度下降。φP0表示電子傳遞的能量占有活性反應中心捕獲的能量的比例, 也反映了PSⅡ最大光化學效率。φE0表示捕獲的光能把電子傳遞到電子傳遞鏈中超過的電子受體的概率, 在鏈霉素處理下, 念珠藻φP0和φE0均顯著低于對照組(圖3B),表明鏈霉素降低了念珠藻光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)用于電子傳遞的能量, 且較多的光能用于還原QA, 導致了念珠藻初級光反應和氧化還原反應被抑制, 進而阻斷了電子從流向光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)。

綜上所述, 高濃度鏈霉素處理, 念珠藻光合結構遭到破壞, 單位面積上有活性的反應中心數(shù)量減少, 光系統(tǒng)Ⅱ電子傳遞受阻, 抑制了光合作用, 導致念珠藻生長受阻。隨著水體抗生素的污染加劇, 探討抗生素的生態(tài)毒理效應尤為重要。然而, 關于抗生素對藻類影響的研究相對較少, 因此, 抗生素對藻類的毒性效應研究仍需要開展大量的工作。