基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016

急性心肌梗死是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌組織壞死，是臨床上的常見病和多發(fā)病，有較高致死致殘率，主要的治療方式是再灌注，即再通冠狀動脈，恢復(fù)組織氧供。但血流的恢復(fù)可致缺血/再灌注(I/R)損傷，最終導(dǎo)致心肌梗死，且面積可達(dá)50%[1]。目前，I/R損傷已證明與氧化應(yīng)激、鈣超載、炎癥反應(yīng)、能量代謝障礙等諸多因素密切相關(guān)，但更詳細(xì)機(jī)制仍未完全明確。維生素C為臨床常見且廣泛使用的抗氧化藥物，川穹嗪在抗氧化應(yīng)激方面的作用已被廣泛認(rèn)同，在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)擬觀察川穹嗪和VitC聯(lián)合應(yīng)用于缺血再灌注心肌損傷的作用效果，重點(diǎn)觀察對家兔心肌I/R心功能、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、丙二醛(malon dialdehyde，MDA)及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)的影響，為藥物聯(lián)合應(yīng)用改善心肌梗死提供思路與理論上的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物及試劑

鹽酸川穹嗪注射液，維生素C注射液。超氧化物歧化酶測定試劑盒、丙二醛測定試劑盒、乳酸脫氫酶測定試劑盒、谷胱甘肽試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。肌鈣蛋白(cTnI)購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 動物和實(shí)驗(yàn)分組

新西蘭大白兔(雄兔)40只，體重2.6～3.0 kg，由濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心提供。隨機(jī)分為4組，每組10只：假手術(shù)組(A組)，只穿線不結(jié)扎冠脈；缺血/再灌注組(B組)；川穹嗪組(C組)；川穹嗪+VitC組(D組)。

1.3 儀器

動物呼吸機(jī)，BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，紫外分光光度計(jì)，離心機(jī)。

1.4 家兔心肌I/R模型的制作[2]

麻醉：自耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(按照30 mg/Kg)，將家兔仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺上。氣管插管：粗剪刀被皮，在距離胸骨上1 cm的正中線處，剪開皮膚，分離皮下組織。胸骨舌骨肌與甲狀軟骨下分離氣管及其與食管之間的結(jié)締組織和肌肉，游離氣管，于氣管下穿兩根較粗結(jié)扎線，于甲狀軟骨下緣1～2 cm處的氣管兩軟骨環(huán)間，做倒“T”形切口，如氣管內(nèi)有血液或分泌物，應(yīng)先用棉簽揩凈，插管，結(jié)扎固定。(注意:上述操作應(yīng)盡快完成以防止麻醉時(shí)間過長對家兔造成過大的不良影響甚至缺氧死亡，在操作過程中可以用止血鉗向外拖拽家兔舌頭刺激其呼吸，減輕呼吸道分泌物對呼吸道的阻塞)。開胸：用止血鉗沿胸骨左緣1～2 cm處夾斷第3、4肋(夾斷肋骨后不要立刻松開止血鉗防止出血，一段時(shí)間后再松開止血鉗)，放入開胸器暴露心臟，剪開心包，提起左心耳暴露心前血管(如果出現(xiàn)氣胸，連接小型動物呼吸機(jī)，呼吸頻率40次/min，潮氣量15 ml/kg)。結(jié)扎：從左心耳根部下約3 mm處進(jìn)針(選用眼科縫合針，創(chuàng)口小，對心壁的損傷小，不易扎破心壁)，結(jié)扎線穿過淺層心肌，橫跨前室間溝從肺動脈圓錐旁出針，放置松解拉線后結(jié)扎冠脈前降支(LAD);結(jié)扎家兔冠狀動脈前降支30 min，隨后提拉松解拉線解除結(jié)扎，再灌注120 min，同時(shí)給予生理鹽水10 ml，靜注5 min(缺血/再灌注組)；結(jié)扎冠狀動脈前降支30 min，隨后提拉松解線解除結(jié)扎，再灌注120 min，同時(shí)給予川穹嗪20 mg/kg加生理鹽水至10 ml靜注5 min(川穹嗪組)；結(jié)扎冠狀動脈前降支30 min，提拉松解線解除結(jié)扎，再灌注120 min，同時(shí)給予川穹嗪20 mg/kg，維生素C 30 mg/kg加生理鹽水至10 ml靜注5 min(川穹嗪+VitC聯(lián)用組)[3]。結(jié)扎成功的標(biāo)志為心電圖ST段弓背向上抬高，松開結(jié)扎線，提拉松解線恢復(fù)冠脈血流，抬高的ST段下降50%以上即證明再灌注成功。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1心功能的測定 頸部皮膚切開后，暴露并鈍性分離出左頸總動脈，結(jié)扎遠(yuǎn)端，由近端將動脈導(dǎo)管自左頸總動脈插入左心室，插管插入動脈初描記波形為動脈血壓，當(dāng)波形變成下沿達(dá)0 mmHg以下具有明顯舒張期而峰頂平坦的波形時(shí)，表明導(dǎo)管已通過主動脈瓣進(jìn)入左室腔內(nèi)，顯示器上所示即為左室內(nèi)壓，一般插入深度約10～12 cm，并經(jīng)壓力換能器與BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連接，計(jì)算機(jī)通過BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，進(jìn)入血流動力學(xué)模塊，記錄缺血前、缺血15 min、缺血30 min和復(fù)灌30 min、復(fù)灌120 min時(shí)左心室收縮峰壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)和左室內(nèi)壓最大收縮/舒張變化速率(±dp/dtmax)。

1.5.2SOD、GSH-PX和LDH活性以及MDA含量檢測 各組于缺血前、缺血30 min和復(fù)灌60 min時(shí)，由股動脈取血2 ml，3000 r/min離心15 min，收集上清。采用南京建成生物工程研究所研制的SOD、GSH-PX、MDA、LDH測定試劑盒進(jìn)行測定，根據(jù)公式，計(jì)算家兔心肌組織中的SOD、GSH-PX和LDH活性以及MDA含量。

1.5.3制作心肌石蠟切片并行HE染色 于復(fù)灌結(jié)束后，原位結(jié)扎左前降支(LAD)，取出心臟，用生理鹽水漂洗心腔內(nèi)積血，沿垂直于心臟長軸的方向，自心尖到結(jié)扎部位，剪下正常組織區(qū)與壞死區(qū)及其相連部分，脫水包埋進(jìn)行HE染色處理：70%乙醇，過夜;80%乙醇，2 h；90%乙醇，1 h；95%乙醇，1 h，1 h；100%乙醇1 h，40～50 min；酒精∶二甲苯為1∶1，30 min；二甲苯，30 min，40 min；浸蠟，2.5 h；待蠟塊凝固后修塊，切片機(jī)切片，展片機(jī)充分展開后，用載玻片承載制成標(biāo)本。HE染色：二甲苯20 min，10 min;無水乙醇，5 min，5 min；95%乙醇，5 min；90%乙醇，2 min；80%乙醇，1 min；蒸餾水，10 min；蘇木素，10 min，蒸餾水沖洗；1%鹽酸酒精，一蘸即可，蒸餾水沖洗；蒸餾水，20 min；伊紅，5 min，蒸餾水沖洗；80%乙醇，3 s；90%乙醇，3 s；95%乙醇，30 s，30 s；無水乙醇，2 min，3 min；二甲苯5 min，10 min；中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。

1.5.4檢測心肌肌鈣蛋白I 采用免疫組化SP法。常規(guī)制備心肌組織切片，脫蠟水化后加入適量的內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min；PBS緩沖液沖洗3 min×3次；滴加100 μL或適量的封閉用山羊血清工作液，室溫孵育10～15 min，傾去血清，勿洗；根據(jù)組織大小，滴加100 μL或適量的一抗，37℃孵育60 min；PBS緩沖液沖洗3 min×3次；滴加100 μL或適量的生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，室溫孵育10～15 min；PBS緩沖液沖洗3 min×3次；滴加100 μL或適量的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育10～15 min；PBS緩沖液沖洗3 min×3次；加入適量新鮮配置的DAB顯色液，室溫孵育5～8 min；自來水沖洗，蘇木素染色液孵育3～5 min；分化，沖洗返藍(lán)；脫水、透明、封片、閱片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 家兔心功能

家兔缺血心肌恢復(fù)供血后，心臟功能進(jìn)一步惡化，川穹嗪能減輕LVSP和±dp/dtmax下降幅度，表明川穹嗪可改善心功能；川穹嗪和VitC聯(lián)用組對心功能的改善更加明顯。見表1。

表1 血流動力學(xué)檢測指標(biāo)

注:與A組比較，#P<0.05;與B組比較，*P<0.05;與C組比較,△P<0.05。

2.2 川穹嗪和VitC對I/R家兔心肌細(xì)胞SOD、MDA和LDH的影響

C組和D組與B組比較，心肌SOD活性增加(P<0.05)，MDA含量下降(P<0.05)，GSH-PX活性增加(P<0.05)，LDH活性下降(P<0.05)；D組與C組比較，心肌SOD活性增加(P<0.05)，MDA含量下降(P<0.05)，GSH-PX活性增加(P<0.05)，LDH活性下降(P<0.05)。見表2。

2.3 各組心肌組織病理學(xué)改變

A組心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，肌纖維炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)充血；B組心肌排列紊亂，心肌細(xì)胞變性，排列整齊；C組心肌細(xì)胞排列較紊亂，有細(xì)胞變性；D組心肌細(xì)胞排列較為整齊，有少量細(xì)胞變性及間質(zhì)充血。見圖1。

2.4 各組心肌組織cTnI表達(dá)

A組心肌細(xì)胞縱切面可見附著于肌橫紋位置棕褐色顆粒呈“橫紋樣”分布，間質(zhì)血管內(nèi)紅細(xì)胞為免疫組化陰性。B組細(xì)胞核細(xì)長固縮偏移染色深,結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞分界不清，胞膜處呈褐色為cTnI大量表達(dá)。C組細(xì)胞形態(tài)較整齊，核破壞較B組輕，且細(xì)胞膜處cTnI呈褐色表達(dá)減少。D組細(xì)胞形態(tài)較整齊，核破壞較輕，且細(xì)胞膜處cTnI呈褐色表達(dá)明顯減少。見圖2。

表2 SOD、MDA和GSH-PX活性以及LDH含量檢測

注:與B組比較，aP<0.05;與C組比較，bP<0.05。

圖1 各組心肌組織病理學(xué)改變(HE×400)

圖2 心肌組織免疫組化染色

3 討 論

自由基的作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、白細(xì)胞的激活(微血管的作用)是缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)的三大重要環(huán)節(jié)，細(xì)胞損傷為缺血再灌注損傷的共同病理改變。本實(shí)驗(yàn)主要關(guān)注兩種藥物聯(lián)用對自由基作用的影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在家兔心肌缺血再灌注的模型中,C組家兔的心肌梗死面積和LDH水平低于B組，且D組效果優(yōu)于C組，表明維生素C與川穹嗪連用可以有效保護(hù)心肌細(xì)胞膜的損傷，減少心肌酶的釋放，改善心肌梗死。

自由基的生成增多來源于黃嘌呤氧化酶(XO)形成增多、中性粒細(xì)胞聚集和激活、線粒體膜損傷、兒茶酚胺自氧化增多，且與鈣超載互為因果作用。缺血后的再灌注過程中產(chǎn)生的大量氧自由基和活性氧可以直接損傷心肌細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能改變，引起細(xì)胞損傷和死亡[4]。SOD、MDA、GSH-PX均為生物體內(nèi)存在的與機(jī)體過氧化反應(yīng)有關(guān)的相關(guān)酶類，為判斷機(jī)體氧化與抗氧化能力、衡量氧自由基產(chǎn)生的指標(biāo)。SOD是內(nèi)源性的氧自由基清除劑，可清除生物體內(nèi)氧化過程中產(chǎn)生的超氧離子，其水平間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA是生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的重要產(chǎn)物，能較好反映組織脂質(zhì)過氧化程度，是判斷氧自由基對細(xì)胞損傷的標(biāo)志之一[5]。GSH-PX可保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能不受過氧化物的干擾和損害，是機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)之一。在本實(shí)驗(yàn)中，與I/R組相比，川穹嗪組SOD、GSH-PX活性增加而MDA含量降低，表明川穹嗪能有效減輕氧化應(yīng)激水平，清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過氧化，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能。這與文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，C、D兩組家兔的心肌梗死面積較B組顯著減少，LDH也顯著降低，提示兩者連用對心肌的保護(hù)作用可能是通過激發(fā)機(jī)體自身的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的結(jié)果，可與上述結(jié)論相互印證，但是否還有其他的酶參與還需進(jìn)一步研究。

cTnI由于其具有嚴(yán)格的心肌組織特異性及高度敏感性，為診斷心肌損傷的特異性指標(biāo)之一，在心肌損傷的診斷及與其他組織損傷的鑒別中具有重要意義。與常規(guī)心肌酶及cTnT相比，在急性期相似的敏感度基礎(chǔ)上，cTnI具有更高的特異性。國內(nèi)外已有少數(shù)關(guān)于心肌缺血梗死cTnI的研究，研究結(jié)果表明，cTnI的檢測要優(yōu)于cTnT和CK-MB，它不僅敏感性、特異性高，且具有更寬的檢測時(shí)間窗[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注后與結(jié)扎前相比，cTnI表達(dá)增加且細(xì)胞外大量表達(dá)，證明缺血再灌注使心肌細(xì)胞受到了損傷；注射川穹嗪后cTnI表達(dá)減少，說明川穹嗪能緩解心肌細(xì)胞的缺血缺氧，減輕了心肌細(xì)胞的再灌注損傷；川穹嗪+VitC組cTnI表達(dá)進(jìn)一步減少，表達(dá)部位集中在細(xì)胞膜，表明兩藥聯(lián)用進(jìn)一步減輕了心肌細(xì)胞受到的損害，并且減少了酶的外漏，在保護(hù)心肌上有良好的效果。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與傳統(tǒng)單獨(dú)使用川穹嗪比較，維生素C與川穹嗪聯(lián)合應(yīng)用能有效的清除MDA、LDH，減輕出血，免疫組化示cTnI溢出減少，心肌組織恢復(fù)情況良好[9]。二者聯(lián)用能進(jìn)一步抑制中性粒細(xì)胞的氧化代謝，清除自由基，降低心肌細(xì)胞的自律性，減少室顫的發(fā)生幾率，對心律失常的發(fā)生具有一定的保護(hù)作用[10-11]。心肌缺血再灌注損傷使心肌的舒縮功能降低，心肌儲能迅速降低破壞，心肌結(jié)構(gòu)比如肌原纖維破壞、線粒體損傷等，引發(fā)心肌頓抑、再灌注性心律失常、心肌壞死等結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可為某些醫(yī)療技術(shù)的應(yīng)用比如冠脈搭橋、PICA、溶栓療法等以及體外循環(huán)條件下進(jìn)行的心臟手術(shù)、心肺腦復(fù)蘇(CPR)等提供治療保護(hù)的新思路。