郭磊周 韓佳慧 唐殷 李江， 黃程 代其林 王勁 平淑珍江世杰

（1. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng) 621010；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

異常球菌屬細(xì)菌是地球上迄今為止發(fā)現(xiàn)的最具輻射抗性的微生物，其中耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）R1是 1956年首次被鑒定的異常球菌屬菌株，該菌對(duì)多種非生物脅迫具有超強(qiáng)的抵抗能力，包括γ-輻射、UV輻射、干燥、高溫以及氧化等［1-3］。在耐輻射異常球菌中存在dr1372（命名為drwH）基因位點(diǎn)，其編碼產(chǎn)物屬于植物干燥抗性相關(guān)的胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（LEA）第5C家族成員［1，4-5］。LEA5C蛋白具有較高疏水性、較低序列重復(fù)性、不穩(wěn)定系數(shù)及小分子氨基酸含量低、熱穩(wěn)定性差等特性，因此是一類非典型LEA蛋白［6-8］。值得注意的是，幾乎所有已發(fā)現(xiàn)的LEA5C蛋白都包含一個(gè)“水脅迫和超敏反應(yīng)結(jié)構(gòu)域（Water stress and hypersensitive response，WHy）”，該結(jié)構(gòu)域與生物體耐受干旱等非生物脅迫密切相關(guān)［9］。

到目前為止，有關(guān)細(xì)菌WHy蛋白的實(shí)驗(yàn)性研究?jī)H有兩個(gè)，即耐輻射異常球菌DrwH蛋白［5］和來源于南極沙漠土壤宏基因組文庫(kù)的dWHy1蛋白［10］。研究報(bào)道，dWHy1蛋白N端含有26個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列，完整野生型dWHy1蛋白在大腸桿菌中異源表達(dá)，其存活率高于只含有空載體的對(duì)照菌株；而缺失信號(hào)肽的截短蛋白dWHy1ΔSP能顯著增強(qiáng)宿主細(xì)胞耐受冷凍脅迫的能力［10］。本研究前期對(duì)來源于耐輻射異常球菌的DrwH核心結(jié)構(gòu)域蛋白Dr-WHy在大腸桿菌中的抗逆功能進(jìn)行初步研究，其在大腸桿菌中表達(dá)能夠增強(qiáng)宿主的氧化脅迫抗性。此外，氧化脅迫（H2O2）條件下，Dr-WHy蛋白對(duì)蘋果酸脫氫酶（MDH）和乳酸脫氫酶（LDH）的酶活性有保護(hù)作用［5］。DrwH從耐輻射異常球菌中發(fā)現(xiàn)，對(duì)其非生物脅迫條件下功能的研究顯得尤為重要。

大量來源于植物或微生物的LEA/WHy蛋白都是以大腸桿菌為底盤生物進(jìn)行研究［11-12］。Liu等［13］采用分段截短及人工合成的方法研究來源于大豆的LEA3家族蛋白PM2的抗逆功能區(qū)域，確定了22-mer的重復(fù)序列在PM2蛋白增強(qiáng)大腸桿菌耐受高鹽脅迫過程中起主要作用。Zou等［14］通過類似的分段截短方法對(duì)大豆LEA1家族蛋白Em進(jìn)行分析，分別構(gòu)建了N末端區(qū)域（Em-N）、中間區(qū)域（Em-2M）及C末端區(qū)域（Em-C）的截短蛋白，研究證明了在體外冷凍脅迫條件下不同結(jié)構(gòu)域?qū)DH的保護(hù)能力（Em-C ＞Em-2M ＞Em-N）。盡管前期已對(duì) DrwH 蛋白進(jìn)行了初步研究，但其一級(jí)結(jié)構(gòu)上某些特征序列是否具有類似于dWHy1中信號(hào)肽的功能，對(duì)核心結(jié)構(gòu)域蛋白WHy的表達(dá)產(chǎn)生影響值得探討。本研究以大腸桿菌為宿主菌株，比較分析drwH基因不同區(qū)域構(gòu)建的重組菌株抗氧化能力的強(qiáng)弱，進(jìn)一步揭示DrwH類信號(hào)肽序列對(duì)其抗氧化功能的影響。DrwH類信號(hào)肽功能的初步研究，將為進(jìn)一步探索耐輻射異常球菌的氧化脅迫抗性分子機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與培養(yǎng)條件 本研究所需要的菌株與質(zhì)粒如表1所示。大腸桿菌于LB培養(yǎng)基（Tryptone 10 g/L，Yeast Extract 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，固體培養(yǎng)基中加入agar 15 g/L）中37℃條件培養(yǎng)。含外源質(zhì)粒的重組大腸桿菌，培養(yǎng)過程中加入相應(yīng)的抗生素（如Kan 50 μg/mL）。

1.1.2 主要試劑 常規(guī)PCR反應(yīng)試劑（PrimeSTAR HS DNA polymerase、dNTPs、Ex Taq酶）購(gòu)自TaKa-Ra公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購(gòu)自NEB公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒均購(gòu)自Magen公司；細(xì)菌RNA提取試劑盒購(gòu)自Promega公司；30% H2O2，所用其他試劑均為分析純。引物合成與測(cè)序均由華大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 使用SignalP 4.1、Phobius等在線軟件進(jìn)行蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析。

1.2.2 重組大腸桿菌構(gòu)建 本研究采用常規(guī)PCR克隆、酶切、連接、轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建重組大腸桿菌菌株，將目的基因連接于pET28a表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E. coliBL21（DE3）獲得重組菌株。具體方法參照文獻(xiàn)［5］。重組質(zhì)粒構(gòu)建所需引物如表2所示，SP-WHy基因由金唯智生物科技公司合成。

1.2.3 重組大腸桿菌抗氧化脅迫實(shí)驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)菌株在LB平板（50 μg/mL Kan）上分別劃線過夜培養(yǎng)，從活化的平板上分別挑取單菌落于3 mL 新鮮液體培養(yǎng)基（50 μg/mL Kan）中37℃過夜培養(yǎng)，按初始OD600為0.05分別接種于20 mL的新鮮LB液體（50 μg/mL Kan）培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 min后加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG于培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)至菌液OD600約為0.5，分別取出1 mL進(jìn)行氧化脅迫處理。向上述1 mL菌液中加入15 mmol/L H2O2，處理10 min后立即10倍梯度稀釋（10-1-10-4），每個(gè)稀釋梯度各取10 μL點(diǎn)在LB固體培養(yǎng)基表面，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)16 h后觀察菌落形成情況。

表2 本研究所用引物列表

1.2.4 重組大腸桿菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 從過夜培養(yǎng)的平板上挑取重組菌株BL21-DrwH、BL21-WHy及對(duì)照菌株BL21-pET單菌落，接種于新鮮的20 mL LB液體培養(yǎng)基中（50 μg/mL Kan），37℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。按初始OD600為0.05分別將種子液接種于50 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中（每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)），37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)，每隔1 h取樣，測(cè)定OD600值，連續(xù)測(cè)定至細(xì)菌生長(zhǎng)穩(wěn)定期。分別以培養(yǎng)時(shí)間和OD600吸光值為橫縱坐標(biāo)，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 qRT-PCR分析基因轉(zhuǎn)錄水平 接種活化的BL21-DrwH、BL21-WHy菌株于新鮮的20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)30 min后加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG于培養(yǎng)基中（對(duì)照不加IPTG），連續(xù)培養(yǎng)至菌液OD600約為0.5，離心收集菌體，使用Promega RNA試劑盒提取菌體總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過qRT-PCR分析基因的表達(dá)水平。每個(gè)實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 DrwH蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析

耐輻射異常球菌基因組數(shù)據(jù)分析顯示，drwH基因位于耐輻射異常球菌R1基因組Ⅰ號(hào)染色體上，該基因全長(zhǎng)495 bp，編碼164個(gè)氨基酸。通過SignalP 4.1和Phobius在線軟件對(duì)蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)顯示（圖1），DrwH蛋白的N端含有19個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽類似序列，該類信號(hào)肽序列組成一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)。

使用DNAMAN對(duì)來自植物、細(xì)菌和古細(xì)菌的48種LEA5C家族蛋白序列比較分析，結(jié)果顯示耐輻射異常球菌DrwH蛋白的WHy結(jié)構(gòu)域與Deinococcus屬同源蛋白的WHy序列一致性最高（41.9%-61.6%），而與其他物種來源的WHy序列一致性僅為20%左右。同時(shí)對(duì)這48種LEA5C家族蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有18種蛋白存在預(yù)測(cè)的信號(hào)肽，其中所有Deinococcus屬來源的蛋白中都存在預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列（11個(gè)），所有細(xì)菌和部分古細(xì)菌中總共有7個(gè)含有預(yù)測(cè)的信號(hào)肽，而植物來源的LEA5C蛋白中均不含預(yù)測(cè)的信號(hào)肽（表3）。

圖1 采用SignalP 4.1和Phobius軟件預(yù)測(cè)DrwH信號(hào)肽

2.2 重組大腸桿菌的構(gòu)建

根據(jù)信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，DrwH蛋白N端含有19個(gè)氨基酸組成的類信號(hào)肽和一個(gè)WHy核心結(jié)構(gòu)域，因此對(duì)DrwH蛋白的不同結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行分段研究（圖3-A），分別構(gòu)建了野生型全長(zhǎng)蛋白DrwH、C端截短蛋白DrwHΔC、N端截短蛋白DrwHΔN、核心結(jié)構(gòu)域蛋白WHy、類信號(hào)肽SP、類信號(hào)肽SP缺失蛋白DrwHΔSP及類信號(hào)肽與WHy的重組蛋白SP-WHy，對(duì)其編碼基因片段通過BamHI/HindIII雙酶切消化后，分別連接于pET28a質(zhì)粒，獲得重組載體，轉(zhuǎn)化E. coliBL21（DE3），構(gòu)建的重組菌株分別命名為BL21-DrwH、BL21-DrwHΔC、BL21-DrwHΔN、BL21-WHy、BL21-SP、BL21-DrwHΔSP和BL21-SP-WHy（表1），重組菌株的構(gòu)建策略如圖2-A所示，重組載體通過PCR、酶切及測(cè)序驗(yàn)證正確（圖2-B顯示28a-drwH和28a-WHy的驗(yàn)證結(jié)果）。

2.3 氧化脅迫抗性分析

為探索DrwH蛋白不同區(qū)域?qū)ζ淇寡趸δ艿挠绊?，本研究?duì)構(gòu)建的BL21-DrwH、BL21-DrwHΔC、BL21-DrwHΔN、BL21-WHy重組大腸桿菌菌株和BL21-pET對(duì)照菌株分別進(jìn)行氧化脅迫處理（圖3-B）。結(jié)果顯示，15 mmol/L H2O2脅迫處理10 min后，表達(dá)截短蛋白DrwHΔN和結(jié)構(gòu)域蛋白WHy的重組菌株與對(duì)照菌株BL21-pET相比，存活能力提高了近3個(gè)數(shù)量級(jí)，而表達(dá)全長(zhǎng)蛋白DrwH和截短蛋白DrwHΔC的重組菌株在H2O2處理后生存能力與對(duì)照菌株都對(duì)氧化沖擊極為敏感。值得注意的是，在未脅迫處理的實(shí)驗(yàn)組，表達(dá)DrwH和DrwHΔC蛋白的重組菌株生存能力與其他菌株相差至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，而這兩種菌株均含有類信號(hào)肽序列SP。

結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果分析，由于全長(zhǎng)蛋白DrwH和截短蛋白DrwHΔC的N端都含有19個(gè)氨基酸的類信號(hào)肽，為進(jìn)一步驗(yàn)證類信號(hào)肽與大腸桿菌生長(zhǎng)受抑制之間的關(guān)系，本研究構(gòu)建了BL21-SP、BL21-DrwHΔSP及BL21-SP-WHy（圖3）。對(duì)構(gòu)建的重組大腸桿菌菌株進(jìn)行15 mmol/L H2O2沖擊10 min，結(jié)果顯示，只要含有類信號(hào)肽SP重組蛋白的菌株，生長(zhǎng)能力均受到不同程度抑制，表明DrwH蛋白的N端19個(gè)氨基酸組成的類信號(hào)肽序列是影響重組大腸桿菌生長(zhǎng)的主要原因。此外，進(jìn)一步表明DrwH發(fā)揮抗氧化功能的主要區(qū)段是核心結(jié)構(gòu)域WHy。

2.4 重組菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定

通過在正常培養(yǎng)條件下（LB培養(yǎng)基），測(cè)定重組菌株BL21-DrwH、BL21-WHy及對(duì)照菌株BL21-pET的生長(zhǎng)曲線，進(jìn)一步分析類信號(hào)肽SP對(duì)重組蛋白的影響。結(jié)果顯示，所有的實(shí)驗(yàn)菌株在0-2 h生

長(zhǎng)時(shí)期沒有變化，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OD600大于0.5時(shí)，表達(dá)結(jié)構(gòu)域蛋白WHy的BL21-WHy與對(duì)照菌株沒有明顯差異，而過量表達(dá)全長(zhǎng)蛋白DrwH的BL21-DrwH菌株生長(zhǎng)明顯受到抑制，最大OD600僅為0.8左右（圖4）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在大腸桿菌中只要表達(dá)包含N端35個(gè)氨基酸（其中含有類信號(hào)肽序列SP）的重組蛋白，就會(huì)影響大腸桿菌菌株的正常生長(zhǎng)。

表3 LEA5C家族蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析

圖2 重組大腸桿菌構(gòu)建（A）與驗(yàn)證（B）

圖3 表達(dá)DrwH不同截短蛋白重組菌株的抗氧表型分析

圖4 過量表達(dá)全長(zhǎng)DrwH和核心結(jié)構(gòu)域WHy蛋白的重組大腸桿菌生長(zhǎng)曲線

2.5 蛋白表達(dá)量對(duì)重組菌株抗氧化能力的影響

此外，本研究對(duì)未誘導(dǎo)（未添加IPTG）的重組菌株BL21-DrwH、BL21-WHy及對(duì)照菌株BL21-pET使用15 mmol/L H2O2處理10 min，結(jié)果顯示，氧化脅迫處理后菌株生長(zhǎng)能力均下降3個(gè)數(shù)量級(jí)，且所有菌株在正常培養(yǎng)和脅迫處理?xiàng)l件下均無差異，對(duì)氧化脅迫的抵抗能力也沒有差別（圖5-A），表明蛋白的表達(dá)量對(duì)重組大腸桿菌菌株的生長(zhǎng)及抗氧化能力有顯著的影響，細(xì)胞中蛋白量累積到一定水平才能發(fā)揮生物學(xué)功能，同時(shí)也證明了類信號(hào)肽SP的毒性效應(yīng)也是在蛋白過量積累后出現(xiàn)的。通過qRTPCR分析了全長(zhǎng)DrwH和核心結(jié)構(gòu)域WHy編碼基因在mRNA水平上的表達(dá)量（圖5-B），結(jié)果顯示經(jīng)0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，drwH和WHy基因的mRNA表達(dá)量比未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)量均顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明，DrwH和WHy蛋白的表達(dá)量積累到較高水平才能發(fā)揮功能，同時(shí)也說明核心結(jié)構(gòu)域N端的類信號(hào)肽序列SP對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)有影響。

圖5 蛋白表達(dá)量對(duì)重組菌株抗氧化能力的影響

3 討論

本研究對(duì)耐輻射異常球菌DrwH蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白N端含有19個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列，基于細(xì)菌中存在信號(hào)肽的說法目前還有待考證，本研究提出類信號(hào)肽序列SP的命名。通過對(duì)DrwH蛋白分段截短并構(gòu)建含有不同區(qū)段的重組大腸桿菌，比較分析重組菌株在正常培養(yǎng)和氧化脅迫下的生長(zhǎng)能力，發(fā)現(xiàn)含有類信號(hào)肽序列SP的全長(zhǎng)DrwH蛋白過量表達(dá)對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，類似于一種毒性效應(yīng)，這與Anderson等［10］對(duì)dWHy1信號(hào)肽的研究結(jié)果一致。利用qRTPCR分析重組菌株BL21-DrwH中drwH基因轉(zhuǎn)錄水平的變化發(fā)現(xiàn)，與未誘導(dǎo)的對(duì)照菌株相比，其表達(dá)量上調(diào)近70倍，表明drwH基因在mRNA水平受誘導(dǎo)。因此我們推測(cè)，DrwH在蛋白水平過量積累會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性，抑制其生長(zhǎng)。

預(yù)測(cè)分析顯示植物來源的LEA5C家族蛋白均不含信號(hào)肽序列，古細(xì)菌中也只有少數(shù)幾個(gè)蛋白存在，而在所有的細(xì)菌LEA5C蛋白中都包含19-29個(gè)氨基酸組成的類信號(hào)肽，相比植物龐大的基因組而言，類信號(hào)肽序列在細(xì)菌相對(duì)緊湊的基因組中存在更顯其重要性。研究顯示，幾乎所有LEA5C家族蛋白都含有WHy結(jié)構(gòu)域，且WHy廣泛存在于植物中，在少數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌中也有發(fā)現(xiàn)［9］。這個(gè)零散的分布可能是由于進(jìn)化過程中，微生物通過結(jié)構(gòu)域的選擇性保留以應(yīng)對(duì)脅迫環(huán)境而發(fā)揮功能［4］，或通過從植物到原核生物的水平轉(zhuǎn)移獲得［9］。結(jié)合WHy結(jié)構(gòu)域進(jìn)化的可能性，類信號(hào)肽在細(xì)菌和少數(shù)古菌LEA5C蛋白中存在，我們推測(cè)這些具有特殊功能的序列是在微生物進(jìn)化過程中選擇性保留以應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫［9］，而植物因其基因組龐大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在進(jìn)化過程中并不需要這樣的類信號(hào)肽序列。另外，預(yù)測(cè)的19個(gè)氨基酸的短肽也可能作為調(diào)控序列，對(duì)細(xì)胞內(nèi)DrwH蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。根據(jù)以上分析，結(jié)合全長(zhǎng)drwH基因突變導(dǎo)致耐輻射異常球菌對(duì)氧化和鹽脅迫極為敏感的現(xiàn)象，我們可以確定，在耐輻射異常球菌中必然存在一種DrwH蛋白的剪切機(jī)制，在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平將未成熟蛋白加工修飾為成熟蛋白，從而發(fā)揮抗逆功能。

到目前為止，研究者對(duì)信號(hào)肽或類信號(hào)肽的存在與基因功能的相關(guān)性開展了一些研究。徐妙云等［15］對(duì)大豆24 kD油體蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)研究表明，前22個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽可能影響了油體蛋白基因在細(xì)菌中的表達(dá)。Nguyen等［16］在P.pastorisX33中克隆了一個(gè)去除信號(hào)肽的內(nèi)皮幾丁質(zhì)酶基因mchit1，并使其表達(dá)分泌，發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽缺失能夠提高酶的產(chǎn)率。Karlsson等［17］對(duì)革蘭氏陰性菌中TonB蛋白N端的信號(hào)肽序列研究表明，信號(hào)肽序列與蛋白TonB在內(nèi)外膜之間的連接有關(guān)。彭蔚宇等［18］對(duì)雞白細(xì)胞介素10的信號(hào)肽體外表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，去除信號(hào)肽的重組質(zhì)粒在胞漿中表達(dá)大量較強(qiáng)的綠色熒光，而含有信號(hào)肽的質(zhì)粒熒光較弱且含量較少。Liu等［19］發(fā)現(xiàn)載脂蛋白M（apoM）未被切割的信號(hào)肽延緩了apoM向細(xì)胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)。Wang等［20］研究發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽的優(yōu)化可以提高1，4-β-甘露糖苷酶活性。同樣，本研究類信號(hào)肽序列過量表達(dá)對(duì)DrwH蛋白發(fā)揮功能產(chǎn)生不利影響，但對(duì)該類信號(hào)肽抑制DrwH蛋白發(fā)揮功能的分子機(jī)制仍不清楚。

4 結(jié)論

本研究分析顯示耐輻射異常球菌DrwH蛋白含有19個(gè)氨基酸組成的類信號(hào)肽序列，對(duì)DrwH蛋白進(jìn)行分段截短及重新組裝，構(gòu)建重組大腸桿菌菌株，并觀察不同菌株在正常培養(yǎng)及氧化脅迫條件下的生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，含有類信號(hào)肽序列的融合蛋白過量表達(dá)不僅顯著抑制了大腸桿菌的生長(zhǎng)，而且使WHy核心結(jié)構(gòu)域失去抗氧化功能。qRT-PCR結(jié)果顯示含類信號(hào)肽全長(zhǎng)蛋白DrwH和結(jié)構(gòu)域蛋白WHy在轉(zhuǎn)錄水平大量累積，誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明蛋白在過量積累條件下發(fā)揮其生物學(xué)功能。