張曉瑛, 潘華奇, 張 盈, 石逸冰, 3, 鮑秀艷, 胡江春*

(1.中國科學院 沈陽應用生態(tài)研究所, 遼寧 沈陽 110016; 2.中國科學院大學, 北京 100049;3.沈陽藥科大學, 遼寧 沈陽 110016)

海洋鏈霉菌由于其獨特的生理和代謝功能，成為海洋微生物活性天然產物的重要來源[1]。研究發(fā)現，海洋鏈霉菌能夠產生豐富的次級代謝產物，包括生物堿、聚酮、氯代物和聚醚類等，其中67%的海洋鏈霉菌代謝產物顯示具有抗寄生蟲、抗癌、抑菌、抗瘧等生物活性[1-2]。可見海洋鏈霉菌是發(fā)現抗生素和藥物先導化合物的重要來源。隨著越來越多的鏈霉菌基因組被測序，發(fā)現它們蘊含大量次級代謝產物合成基因簇，然而在常規(guī)實驗室培養(yǎng)條件下，大多數的基因簇是沉默或者低表達的。激活這些沉默或者低表達的基因簇，促使其產物增強表達成為深入挖掘次級代謝產物的主要策略。阻斷菌株主要代謝產物調控基因和合成基因，促使沉默基因簇或者低表達基因簇代謝產物的表達，已成為挖掘代謝產物的重要方式[3-4]。Becerril等[5]用阿泊拉霉素抗性基因，替換了Streptomycesargillaceus的adpAa基因，阻斷adpAa基因表達，激活了殺菌素基因簇；余貞等[6]通過阻斷變鉛青鏈霉菌的負調控基因nsdA，激活了變鉛青鏈霉菌中沉默放線紫紅素生物合成基因簇的表達；Song等[7]用阿普拉霉素抗性基因替換了天藍色鏈霉菌中的Gcs(sco7221 ORF)，產生isogermicidins A-C 三個新型天然產物?？ㄎ闋柺湘溍咕鶱A4由本課題組從中國南海深海沉積物中分離，前期研究從NA4中分離得到兩個主要抗真菌活性的化合物bafilomycins B1和C1，產量分別為23.45 mg/L和6.60 mg/L[8]。進一步基因組挖掘發(fā)現，NA4不但能合成已鑒定的bafilomycins，而且具有合成lantipeptide AmfS、alkylresorcinol、frontalamide、desferrioxamine_B、nonactin、ectoine、isorenieratene、rabelomycin、lassopeptide SRO15-2005及其他未知結構類型化合物的潛能[9]。為了改變NA4菌株的代謝流，隨機激活其他類型的次級代謝產物，課題組前期通過PCR-targeting技術構建了阻斷NA4主產物bafilomycins的突變菌株ΔbafAI[10]。本研究旨在研究突變菌株ΔbafAI隨機激活或促使產量顯著提高的次級代謝產物，并對隨機激活的代謝產物進行分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 卡伍爾氏鏈霉菌(Streptomycescavourensis) NA4，bafilomycins合成阻斷突變菌株ΔbafAI；指示真菌：立枯絲核病菌(Rhizoctoniasolani)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、白色念珠菌(Candidaalbicans)；指示細菌：大腸埃希菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、大黃歐文氏菌(Erwiniacarotovora)和丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)，以上菌株均由本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 ① SFM培養(yǎng)基：黃豆餅粉20 g(水中煮沸40 min，無需過濾)，甘露醇20 g，自來水1 L，瓊脂條20 g；② R5培養(yǎng)基：蔗糖103 g，K2SO40.25 g，MgCl2·6 H2O 10.12 g，葡萄糖10 g，酪氨酸0.1 g，酵母提取物5 g，K2HPO40.5 g，1倍微量元素液1 mL，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4；(1倍微量元素液成分：FeSO4·7 H2O 0.1 g，MnCl2·4 H2O 0.1 g，ZnSO4·7 H2O 0.1 g，蒸餾水1 L)；③ TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4；④ PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自然pH；⑤ 沙氏培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。

1.1.3 儀器與試劑 超凈操作臺(BCN-1360B,北京東聯哈爾儀器制造有限公司)；立氏壓力蒸汽滅菌鍋(YSQ-LS-50S11,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；數控超聲波清洗器(KQ3200DB，昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀(RE52-99 上海亞榮生化儀器廠)；恒溫搖床(DHZ-C，大倉市實驗儀器有限公司)；高效液相色譜儀(Ultimate-3000，美國賽默飛世爾科技公司)；核磁共振儀(AV-600，Bruker)；Sephadex LH20(美國GE公司)；靜電場軌道阱高分辨質譜(Q Exactive MS，美國賽默飛世爾科技公司)；色譜甲醇(國藥化學試劑有限公司)；氘代試劑(美國劍橋CIL產品)。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)和發(fā)酵 在SFM培養(yǎng)基平板劃線突變菌株ΔbafAI(添加終濃度50 μg/mL的阿普拉霉素和50 μg/mL的甲氧芐氨嘧啶)和野生菌株NA4，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72 h，然后用挖塊法接種于裝有50 mL R5培養(yǎng)基的錐形瓶，置于28 ℃恒溫搖床，180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h后用作種子液，將種子液轉接到含有1 L R5培養(yǎng)基的錐形瓶，置于28 ℃恒溫搖床，180 r/min振蕩培養(yǎng)168 h，發(fā)酵總體積為30 L。

1.2.2 發(fā)酵粗提物制備 將發(fā)酵液4 000 r/min離心20 min，每升上清液加大孔吸附樹脂HP20 60 mL，置于28 ℃恒溫搖床，180 r/min振蕩2 h，收集樹脂，用無水甲醇洗脫3次，收集到的萃取物減壓濃縮干燥得到發(fā)酵粗提物30.29 g。

1.2.3 化合物分離純化和結構鑒定 將發(fā)酵粗提物用硅膠快速柱色譜法初步純化，用二氯甲烷∶甲醇(體積比，100∶ 0、100∶2、100∶4、100∶7、100∶10、100∶15、100∶30、100∶50和0∶100)梯度洗脫。100∶2洗脫得到的餾分利用Sephadex LH20凝膠柱色譜分離，流動相為等體積的二氯甲烷和甲醇，分成Fr.A和Fr.B；將Fr.A利用半制備HPLC(30% MeOH)分離，得到化合物① 26 mg，② 21.6 mg，③ 48.9 mg，④ 7.9 mg。100∶4洗脫得到的餾分利用58%甲醇制備，得到化合物a 1.3 mg。100∶7洗脫得到的餾分首先利用ODS柱進行分離，得到45%甲醇洗脫餾分Fr.C；然后將餾分Fr.C利用半制備HPLC(48% MeOH)分離，再利用Sephadex LH20凝膠柱色譜純化，流動相為等體積二氯甲烷和甲醇，得到化合物⑤2.4 mg。100∶10 MeOH洗脫得到的餾分利用半制備HPLC(25% MeOH)分離，得到化合物⑥6.1 mg。將分離得到的化合物通過NMR和Q Exactive MS進行結構鑒定。

1.2.4 化合物抗菌活性測定 ① 抗絲狀真菌活性測定∶在PDA平板中央接種黃瓜枯萎病菌和番茄灰霉病菌，待病原菌生長至菌落直徑4 cm時，在濾紙片加10 μL待測樣(甲醇溶解，濃度1 mg/mL)，揮干甲醇后對稱放置在病原真菌四周，立枯絲核菌生長速度快，可以和濾紙片同時放置，濾紙片的直徑為8 mm，10 μL無水甲醇作為陰性對照，10 μL 1 mg/mL的布雷菲德菌素為陽性對照，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h(立枯絲核病菌)，48 h(黃瓜枯萎病菌和番茄灰霉病菌)，用游標卡尺測量抑菌圈直徑大小。② 抗細菌和酵母樣真菌活性測定∶取活化好的指示菌平板，用接種環(huán)刮取一環(huán)菌體，制成菌體濃度為107～108cfu/mL的菌懸液(細菌培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基，白色念珠菌培養(yǎng)基為沙氏培養(yǎng)基)，將菌液稀釋100倍，濃度變?yōu)?05～106cfu/mL。實驗在96孔板上進行，設10個濃度梯度，每個梯度設3個重復。在96孔板的第一列中加入20 μL甲醇溶解的1 mg/mL的待測樣品，在無菌操作臺揮干甲醇，在96孔板的第一孔加入200 μL培養(yǎng)基，混勻后從第一孔中取100 μL至第二孔，加等量培養(yǎng)基混勻，再取100 μL至下一孔，依次操作，倍比稀釋，最后一孔混勻后棄去100 μL，在每孔中加入100 μL稀釋的菌懸液，使每孔體積保持在200 μL。此時第1孔至第10孔的濃度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 3、0.390 6、0.195 3 μg/mL，陰性對照分別為含菌培養(yǎng)基和不含菌培養(yǎng)基，陽性對照為氯霉素(抗細菌活性)和布雷菲德菌素(抗白色念珠菌活性)。將上述96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，12 h后肉眼觀察，待測樣品最低濃度孔無渾濁出現者，即為受試菌的最低抑制濃度。

1.2.5 ABTS自由基清除活性測定[11]將配好的ABTS·+溶液用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋，約稀釋22倍，稀釋后避光放置30 min，用紫外分光光度計測定吸光度值，吸光度值(0.7±0.02)為合格，可以使用。吸取稀釋的供試品溶液各100 μL和ABTS·+溶液100 L至96孔板中，混勻，室溫暗處反應6 min，734 nm處測定吸光度，每個供試品重復測定3次，陽性對照為維生素C，陰性對照為100 μL的無水乙醇。ABTS·+清除率計算公式如下:清除率%=(1-Asamp/Acont)×100%，其中Asamp代表供試品溶液的吸光度值，Acont代表陰性對照溶液的吸光度值，通過SPSS軟件進一步計算EC50值(μmol/L)。

2 結果與分析

2.1 突變菌株ΔbafAI代謝粗提物HPLC-DAD分析

將突變菌株和野生菌株代謝產物進行HPLC-DAD分析，結果發(fā)現突變菌株ΔbafAI的代謝產物與野生株代謝產物相比，在保留時間9.0～17.0 min和30.0～33.0 min明顯不同。在突變株ΔbafAI中，保留時間在30.0～33.0 min的bafilomycins消失，而保留時間9.0～17.0 min許多色譜峰(化合物1～6和a)則顯著增強(圖1)。推測在阻斷NA4主產物bafilomycins合成基因后，突變菌株代謝流發(fā)生改變，使原低表達代謝物轉變?yōu)楦弑磉_，產量顯著增加。

圖1 突變菌株ΔbafAI和野生菌株NA4發(fā)酵液代謝產物圖譜(UV: 200～400 nm)

2.2 化合物結構鑒定

從NA4突變菌株ΔbafAI的次級代謝產物中共分離得到6個隨機激活的單體化合物(圖2)，結構鑒定如下：

圖2 突變菌株ΔbafAI中分離的化合物結構

2.1.1 化合物1 無色晶體(甲醇)；HPLC-DAD檢測最大吸收波長為210 nm，HR-ESI-MS給出m/z：211.144 5[M+H]+，確定其相對分子質量為210.136 7，推導其分子式為C11H18N2O2。進一步根據1H-NMR和13C-NMR數據鑒定化合物1為環(huán)(L-異亮氨酸-L-脯氨酸)[12-13]。具體信號如下：1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δH：7.96(1H，s，H-8)，4.10(1H，t，J=7.0 Hz，H-6)，3.94(1H，s，H-9)，3.37(2H，m，H-3)，2.12(1H，m，H-5a)，2.01(1H，m，H-10)，1.81(3H，m，H-4，5b)，1.30(2H，m，H-11)，0.97(3H，d，J=7.1 Hz，H-13)，0.81(3H，t，J=7.4 Hz，H-12)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δC：170.1(C-7)，165.3(C-1)，59.2(C-6)，58.2(C-9)，44.7(C-3)，34.9(C-10)，27.9(C-5)，23.9(C-11)，22.1(C-4)，15.0(C-13)，12.3(C-12)。

2.2.2 化合物2 無色晶體(甲醇)；HPLC-DAD檢測最大吸收波長為210 nm，HR-ESI-MS給出m/z：197.129 1[M+H]+，確定其相對分子質量為196.121 3，推導其分子式為C10H16N2O2。進一步根據1H-NMR和13C-NMR數據鑒定化合物2為環(huán)(L-纈氨酸-L-脯氨酸)[12-13]。具體信號如下：1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δH：7.96(1H，s，H-8)，4.11(1H，t，J=7.3 Hz，H-6)，3.90(1H，s，H-9)，3.37(2H，m，H-3)，2.33(1H，m，H-5)，1.81(2H，m，H-4)，1.78(1H，m，H-10)，1.00(3H，d，J=7.2 Hz，H-11)，0.83(3H，d，J=6.8 Hz，H-12)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δC：170.3(C-7)，165.2(C-1)，59.5(C-6)，58.3(C-9)，44.6(C-3)，27.9(C-5)，27.7(C-10)，22.1(C-4)，18.4(C-11)，16.4(C-12)。

2.2.3 化合物3 無色晶體(甲醇)；HPLC-DAD檢測最大吸收波長210 nm，HR-ESI-MS給出m/z：211.144 5[M+H]+，確定其相對分子質量為210.136 7，推導其分子式為C11H18N2O2。進一步根據1H-NMR和13C-NMR數據鑒定化合物3為環(huán)(L-脯氨酸-L-亮氨酸)[12-3]。具體信號如下：1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δH：8.00(1H，s，H-8)，4.18(1H，t，J=8.0 Hz，H-6)，3.99(1H，t，J=6.2 Hz，H-9)，3.35(2H，m，H-3)，2.10(1H，m，H-5a)，1.83(5H，m，H-4，5b，10)，1.33(1H，m，H-11)，0.85(6H，t，J=6.0 Hz，H-12，13)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δC：170.4(C-7)，166.6(C-1)，58.5(C-6)，52.6(C-9)，44.9(C-3)，37.8(C-10)，27.4(C-5)，24.1(C-11)，22.8(C-12)，22.5(C-4)，21.9(C-13)。

2.2.4 化合物4 無色油狀(甲醇)；HPLC-DAD檢測最大吸收波長210 nm，HR-ESI-MS給出m/z：245.129 0[M+H]+，確定其相對分子質量為244.121 2，推導其分子式為C14H16N2O2。進一步根據1H-NMR和13C-NMR數據鑒定化合物4為環(huán)(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)[13]。具體信號如下：1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δH：8.00(1H，s，H-8)，7.23(5H，m，H-2′-6′)，4.33(1H，t，J=4.92 Hz，H-9)，4.06(1H，t，J=8.88 Hz，H-6)，3.38(1H，m，H-3)，3.26(1H，m，H-3)，3.06(1H，dd，J=14.2，5.3 Hz，H-10)，3.01(1H，dd，J=14.2，2.8 Hz，H-10)，2.00(1H，m，H-5)，1.71(2H，m，H-4)，1.40(1H，m，H-5)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δC：169.1(C-7)，165.1(C-1)，137.3(C-1′)，129.8(C-2′，6′)，128.0(C-3′，5′)，126.3(C-4′)，58.4(C-6)，55.7(C-9)，44.6(C-3)，35.3(C-10)，27.8(C-5)，21.9(C-4)。

2.2.5 化合物5 無色針狀物(甲醇)；HPLC-DAD檢測最大吸收波長307 nm，HR-ESI-MS給出m/z：221.081 4[M+Na]+和190.086 7[M+H]+，確定其分子量為189.078 9，推導其分子式為C11H11NO2。進一步根據1H-NMR和13C-NMR數據鑒定化合物5為(2E, 4E)-5-(3-羥苯基)-戊-2, 4-二烯酰胺[14]。具體信號如下：1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：9.44(1H，s，-OH)，7.46(1H，m，-NH2)，7.14(2H，m，J= 5.5，15.0 Hz，H-3，4)，6.97(2H，m，H-10，11)，6.91(2H，m，H-7，9)，6.83(1H，d，J=15.5 Hz，H-5)，6.70(1H，m，-NH2)，6.10(1H，d，J=15.0 Hz，H-2)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δC：166.9(C-1)，157.6(C-8)，139.6(C-3)，138.2(C-5)，137.6(C-6)，129.7(C-10)，126.8(C-4)，125.5(C-2)，117.9(C-11)，115.7(C-9)，113.5(C-7)。

2.2.6 化合物6 白色粉末(甲醇)；HPLC-DAD檢測發(fā)現最大吸收波長248 nm，HR-ESI-MS給出m/z：299.061 6[M+H]+，確定其相對分子質量為298.053 8，推導其分子式為C11H14N4O4S。進一步根據1H-NMR和13C-NMR數據鑒定化合物6為5′-脫氧-5′-甲硫肌苷[15]。具體信號如下：1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δH：8.32(1H，s，H-8)，8.07(1H，s，H-2)，5.86(1H，d，J=5.8 Hz，H-1′)，4.62(1H，m，H-2′)，4.09(1H，m，H-3′)，4.02(1H，m，H-4′)，2.85(1H，dd，J=13.9 Hz，J= 5.9 Hz，H-5′a)，2.75(1H，dd，J=13.9 Hz，J=6.9 Hz，H-5′b)，2.05(3H，s，-SCH3)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δC：156.6(C-4)，148.4(C-6)，146.0(C-2)，139.0(C-8)，124.5(C-5)，87.3(C-1′)，83.9(C-4′)，73.1(C-2′)，72.5(C-3′)，36.0(C-5′)，15.6(-SCH3)。

2.3 化合物抗菌活性測定

抗菌活性結果顯示化合物1和2對白色念珠菌有抑制作用，最小抑制濃度均為50 μg/mL，比對照布雷菲得菌素的活性低(3.125 μg/mL)，6個單體化合物在最大濃度100 μg/mL時對細菌(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、大黃歐文氏菌和丁香假單胞菌)未檢測到活性；在1 mg/mL濃度時病原真菌(立枯絲核病菌、番茄灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌和白色念珠菌)也未檢測到活性。

2.4 化合物對ABTS自由基的清除活性

采用ABTS方法測試化合物對自由基的清除活性，化合物5濃度5 μmol/L時清除率為(8.63 ± 0.85)%，濃度10 μmol/L時清除率為(14.85 ± 0.41)%，濃度50 μmol/L時清除率為(58.89 ± 3.15)%，濃度100 μmol/L時清除率為(78.05 ± 3.39)%，濃度200 μmol/L時清除率為(80.59 ± 4.90)%。通過SPSS軟件計算，化合物5的EC50值為(39.73±2.97) μmol/L，陽性對照維生素C的EC50值為(6.12±0.17) μmol/L。實驗結果表明化合物5具有一定的自由基清除活性，但比維生素C的自由基清除活性低。

3 討 論

本研究對阻斷NA4主產物bafilomycins的突變株ΔbafAI隨機激活的代謝產物進行分離和鑒定?？偣驳玫?個化合物，均是首次從該菌中分離得到的；化合物1～6均是阻斷NA4主產物之后產量提高的化合物；生物活性測定結果發(fā)現化合物1和2顯示較弱的抗白色念珠菌活性，并首次發(fā)現了化合物5的抗氧化活性；圖1中的化合物a雖然對大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌和立枯絲核菌都顯示出較好的抑制作用，但是由于量較少，所以未能進行結構解析。文獻調研發(fā)現環(huán)(L-異亮氨酸-L-脯氨酸)對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus)有抑制作用[16]；環(huán)(L-亮氨酸-L-脯氨酸)顯示細胞毒活性，能夠抑制K562細胞、HL-60細胞、BGC-823細胞和HeLa細胞[17]；環(huán)(L-纈氨酸-L-脯氨酸)對尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、青霉菌(Penicilliumsp.)和前列腺癌細胞LNCaP有抑制作用[18-19]；環(huán)(L-亮氨酸-L-脯氨酸)和環(huán)(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)組合使用對抗萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistantEnterococci)有較強的抑制作用[20]；(2E, 4E)-5-(3-羥苯基)-戊-2, 4-二烯酰胺對結核分枝桿菌有較強的抑制作用[14]。綜上文獻調研發(fā)現環(huán)二肽類化合物具有多種抗菌和抗腫瘤活性，可見環(huán)二肽類化合物在藥物及其相關研究領域中有著巨大的發(fā)掘潛力。

挖掘菌種次生代謝產物方法有多種，包括傳統(tǒng)OSMAC策略[21]，插入強啟動子激活正調控基因[22]，阻斷負調控基因[23]，核糖體工程[24]，加入小分子物質[25]，共培養(yǎng)[26]等方式激活沉默基因簇。本研究嘗試了阻斷NA4主產物來非特異激活其他次級代謝產物的產生。當阻斷NA4主產物合成基因后，突變菌株代謝流發(fā)生改變，增加了其他代謝物的積累；同時，去除原主產物后簡化了NA4菌株代謝產物分離過程中背景信息干擾，有利于微量化合物分離，提高新的化合物和微量化合物分離的幾率，這一策略為微生物代謝產物的分離純化提供了有益借鑒。本研究也進一步豐富了Streptomycescaverounsis代謝產物成分研究以及生物活性研究，為深入挖掘該菌潛在活性次級代謝產物提供了素材。