尚信池， 盧玉婷， 程 義， 代 靜， 李月紅

(吉林農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院 教育部動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質量安全重點實驗室，吉林 長春 130118)

在哺乳動物中，宿主細胞感染病毒會觸發(fā)先天性免疫應答，其特征在于誘導干擾素(IFN)和下游IFN刺激基因(ISGs)參與免疫應答[1]。一旦病毒克服了物理和化學障礙，它將被宿主細胞的模式識別受體(PRRs)識別。在感染病毒期間，機體通過多種途徑對RLRs介導的天然免疫進行復雜調(diào)控，產(chǎn)生一個病毒-RLRs-IFN互聯(lián)反饋回路，確保RLRs維持適當?shù)目共《拘盘査絒2]。大量研究表明，RNA病毒感染通常被宿主細胞質受體識別，即視黃酸誘導基因I樣受體(RLRs)，DNA受體識別DNA病毒感染，如細胞內(nèi)cGAS(環(huán)狀GMP-AMP合成酶)、DAI(IRF的DNA依賴性激活劑，也稱為ZBP-1)、IFI16(IFN-γ-誘導蛋白16)等[3]。在硬骨魚中，病毒感染會激活宿主天然免疫IFN抗病毒反應信號通路[4]，其中RLRs信號通路起到重要作用，通路中涉及的關鍵信號分子，如RIG-I、MDA5、MAVS、MITA、TBK1和IRF3/7，已在許多魚類中得到鑒定[5]。病毒感染后，魚類的這些基因會顯著誘導天然免疫應答，并且過度表達導致IFN和ISG的上調(diào)以及宿主抗病毒狀態(tài)的建立[6-11]。此外，研究表明魚類具有保守RLR途徑以引發(fā)IFN表達和抗病毒反應。SVCV是一種負義單鏈RNA病毒，主要在鯉科魚類中引起急性出血和傳染性疾病，尤其是鯉[12-13]。由于其對魚類的巨大傷害，SVCV感染的斑馬魚模型已被用于研究魚類抗病毒免疫能力[14-15]，通過使用這種病原體模型，魚類干擾素受體已經(jīng)確定[16]。此外，通過研究感染SVCV的不同來源的魚類細胞系，發(fā)現(xiàn)魚類抗SVCV過程中IFN通常會被上調(diào)[17-19]?，F(xiàn)已有研究證實，RLRs不僅可活化天然免疫抗病毒通路，還可增強適應性免疫效應，在控制病毒感染過程中發(fā)揮重要作用，現(xiàn)對RLRs信號通路及其抗病毒信號調(diào)節(jié)因子和抗SVCV免疫的研究進展進行綜述。

1 RLRs家族

RLRs屬于DEx D/H box helicase家族，為胞質PRRs[2]。RLRs家族包括維甲酸誘導型基因I(RIG-I)、黑色素瘤分化相關基因5(MDA5)及遺傳學和生理學實驗室蛋白2(LGP2)三個成員[20]，通常可識別胞質內(nèi)病毒的RNA。

RLR通過中心DExD/H-box解旋酶結構域識別病毒RNA，隨后通過N-末端募集結構域(CARD)將信號轉導至下游分子。這種識別方式招募并激活下游銜接蛋白線粒體抗病毒信號傳導(MAVS)，進一步導致絲/蘇氨酸蛋白激酶(TANK-binding kinase 1，TBK-1)的激活。活化的TBK1反過來磷酸化并激活IFN調(diào)節(jié)因子IRF3/7(interferon regulatory factor，IRF)以誘導I型IFN產(chǎn)生和IFN刺激的基因(ISG)的表達以建立宿主抗病毒狀態(tài)。IFN基因刺激物(STING，也稱為MITA)，可以激活TBK1-IRF3/7-IFN[3]。線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)和MITA通過TBK1介導的磷酸化依賴性機制激活IRF3誘導Ⅰ型IFN及IFN刺激基因(ISG)的表達，誘發(fā)抗病毒天然免疫反應[4]。

動物在應對病毒感染時，入侵的病毒被RIG-I或者MDA5識別，再通過MAVS傳遞信息，隨后TBK-1磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子IRF3和IRF5，最終激活IFN-Ⅰ的表達，調(diào)節(jié)天然免疫或者再激活下游細胞因子，發(fā)揮抗病毒作用[21]。LGP2則作為正調(diào)控因子參與RLR抗病毒信號通路。Zou等[22]研究魚類RIG-I發(fā)現(xiàn)，當SVCV的感染復數(shù)(MOI)分別為0.1和1，轉染的RIG-Ib過表達時，鯉上皮瘤(EPC)細胞上清液病毒滴度分別為1.88×104pfu/mL和2.23×103pfu/mL，與對照相比降低了70倍和1 082倍，并且RIG-Ib重組質粒(10 ng)EPC細胞中表達，導致I型IFN啟動子活性顯著增加。這些證據(jù)說明外源RIG-Ib能夠強烈的誘導IFN-Ⅰ產(chǎn)生，以抵抗SVCV的感染。研究發(fā)現(xiàn)[23-24]，青魚(black crop，bc)感染SVCV后，多個器官bcLGP2 mRNA表達上調(diào)，而MDA5只在肌肉和腎中表達量較高。體外實驗q-PCR結果顯示低劑量SVCV處理青魚鰭條組織(MPF)細胞，可上調(diào)其bcLGP2和bcMDA5的轉錄。并且相比對照組，轉染bcMDA5質粒的EPC細胞可以減弱SVCV感染造成的細胞病變效應(CPE)，細胞上清液中的病毒滴度也顯著降低。同時也發(fā)現(xiàn)將表達bcMDA5和LGP2兩種重組質粒共轉染進EPC細胞，青魚干擾素(eIFN)表達量比單獨轉染兩種表達質粒時顯著提高。以上結果說明LGP2和MDA5是細胞重要的抗病毒因子，LGP2與MDA5可共同識別SVCV的RNA，提高eIFN的表達，且LGP2增強MDA5介導抗病毒作用[25]。

2 RLRs抗病毒信號調(diào)控因子與IFN-I的產(chǎn)生

RIG-I，MDA-5和LGP2都識別核糖核酸。RIG-I做為病毒RNA胞質傳感器的作用就是感知RNA病毒的感染。RIG-I主要識別5′端三磷酸化的單鏈RNA(ssRNA)和短雙鏈RNA(dsRNA)模擬物如poly Ⅰ：C、poly Ⅰ：U等，而MDA5主要識別長dsRNA和包含ssRNA及dsRNA在內(nèi)的RNA結構域。雖然能識別不同類型的病毒，但都需要適配子MAVS介導的固有免疫防御，并且需要共同合作來增強對正負鏈RNA病毒感染的有效應答。并且RIG-I和MDA-5還能通過MAVS誘導TRIM和TRAFs等適配子和細胞因子的信號傳導[26]。誘導干擾素和促炎癥細胞因子的產(chǎn)生，從而啟動先天免疫應答并且調(diào)節(jié)隨后的獲得性免疫應答，增強機體抵抗病毒的能力。下面對幾種調(diào)控因子在抗SVCV時產(chǎn)生的作用做一詳細的綜述。

2.1 MAVS

線粒體抗病毒蛋白(MAVS)作為一些信號通路的調(diào)控樞紐，具有招募調(diào)控下游細胞因子抗病毒的作用。Zhou等[27]研究發(fā)現(xiàn)，bcMAVS在青魚組織內(nèi)廣泛表達，青魚感染SVCV后，脾中bcMAVS表達下降，肌肉和肝部表達上調(diào)。體外實驗中外源bcMAVS在EPC細胞中表達，以劑量依賴性方式誘導斑馬魚IFN啟動子活性。Xiao等[28]研究發(fā)現(xiàn)，MAVS的跨膜結構(TM)和N-末端半胱天冬酶募集結構域(CARD)對其抗病毒和誘導IFN表達至關重要。在免疫熒光顯微鏡下觀察到，感染SVCV后只有具有CARD和TM結構域的bcMAVS才能在EPC細胞線粒體中形成聚集體。熒光素酶報告基因測定顯示bcMAVS在EPC細胞中表達，以劑量依賴性方式誘導斑馬魚IFN啟動子活化并且呈正相關，而缺少CARD和TM結構域的bcMAVS對IFN的活化幾乎沒有影響。表達HA-bcMAVS重組質粒的EPC細胞，通過與對照組比較SVCV滴度和細胞病變效應指標，發(fā)現(xiàn)EPC細胞抗病毒能力提高。以上數(shù)據(jù)顯示，MAVS的TM和CARD結構域對其招募下游細胞因子和自身聚集以發(fā)揮抗病毒作用至關重要，MAVS廣泛存在于魚體內(nèi)，當病毒入侵時，通過招募其他細胞因子誘導IFN-I表達，發(fā)揮抗病毒作用。Gong等[1]研究表明，MAVS和MITA的顯性失活突變體MAVS-ΔTM與MITA-CT的過表達削弱了SVCV對魚類IFN啟動子的激活。MAVS-ΔTM和MITA-CT的明顯阻斷作用可能是通過SVCV調(diào)節(jié)IRF3和雙鏈RNA依賴的蛋白質激酶(PKR)的表達，因為MAVS-ΔTM表現(xiàn)出比MITA-CT更好的抑制作用。結果表明，魚類MAVS和MITA都是SVCV觸發(fā)的IFN表達所必需的。這些結果共同闡明了RLR介導的IFN信號傳導的保守性，這有助于魚類對RNA病毒感染做出反應。

2.2 STING

STING作為一種 IFN 刺激因子被發(fā)現(xiàn)，并在大量組織多種細胞中廣泛表達，提示其在免疫調(diào)節(jié)方面可能具有十分重要的功能[29]。Lu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，感染SVCV青魚的bcSTING 在魚體腎臟表達上升，在肝、皮膚、心臟、脾中表達下降。體外實驗中，使用SVCV(MOI=0.1)處理青魚(Mylopharyngodonpiceus)尾鰭細胞可以誘導bcSTING mRNA大量表達。在熒光素酶報告實驗中，HA-bcSTING呈現(xiàn)出強烈的IFN誘導活性，bcSTING-HA卻沒有該能力。但兩者分別轉染EPC細胞表達后進行SVCV感染，都能減輕EPC細胞的細胞病變效應，顯著降低細胞上清液的病毒滴度，使EPC細胞具有抗病毒能力。這些數(shù)據(jù)可推測，bcSTING對病毒核酸有一定的識別能力，其C端結構對誘導IFN活性至關重要。外源性bcSTING顯著提高了EPC細胞對SVCV抗病毒能力，表明bcSTING在青魚抗病毒先天免疫應答中起重要作用。

2.3 TRAF6

腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAFs)家族是一類胞內(nèi)接頭蛋白，能直接或間接與Toll樣受體接合，也能激活NF-κB信號通路，在天然免疫過程中發(fā)揮重要作用。Jiang等[31]發(fā)現(xiàn)，bcTRAF6 mRNA在青魚組織內(nèi)廣泛表達，感染SVCV青魚的不同組織bcTRAF6 mRNA表達均上調(diào)，其中鰓、皮膚、肝臟顯著上調(diào)。MPF細胞感染SVCV后bcTRAF6 mRNA表達顯著上調(diào)，表達量最高為5.2倍(MOI=0.1，72 h point)。結晶紫染色法結果發(fā)現(xiàn)，轉染并表達bcTRAF6的EPC細胞，在感染SVCV后，CPE和細胞上清病毒滴度跟對照組相似。同樣在熒光素酶報告實驗中發(fā)現(xiàn)EPC細胞轉染并過表達bcTRAF6，對斑馬魚 IFN3和青魚IFN沒有影響，而外源bcTRAF6在青魚腎(Mylopharyngodonpiceuskidney，MPK)細胞中以劑量依賴的方式觸發(fā)NF-κB的轉錄。因此他們嘗試將bcMAVS和bcTRAF6重組質粒共轉染或單獨轉染EPC細胞，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)細胞質的bcTRAF6蛋白消失，在線粒體處與bcMAVS疊加在一起。使用熒光素報告實驗測定證實了外源bcTRAF6可以通過其他途徑介導MAVS來調(diào)節(jié)eIFN的表達。

2.4 TRAF2

TRAF2作為TRAF家族成員，參與NF-kB通路。Chen等[32]研究發(fā)現(xiàn)，bcTRAF2 mRNA在青魚組織內(nèi)廣泛分布，感染SVCV后，魚體心臟和鰓bcTRAF2 mRNA表達量下降，其他組織表達上調(diào)。使用不同濃度SVCV(MOI=0.01、0.1、1)處理MPF細胞，發(fā)現(xiàn)在48 h時，bcTRAF2 mRNA相對表達量顯著提高，分別達到2.77、4.53、4.12倍。熒光素酶報告實驗表明bcTRAF2過表達呈劑量依賴方式誘導NF-kB的轉錄，對斑馬魚IFN I的誘導幾乎沒有作用?？瞻咴囼灲Y果顯示，表達bcMAVS和bcTRAF2的EPC細胞培養(yǎng)液中的病毒滴度，低于表達bcMAVS的EPC細胞，并且隨著bcTRAF2劑量增加，SVCV滴度降低。以上數(shù)據(jù)證明單獨的外源bcTRAF6或bcTRAF2都不能激活Toll樣受體信號通路，更不能誘導IFN的表達以此提高EPC細胞的抗病毒能力，但都能激活NF-κB的轉錄，通過MAVS和NF-kB信號通路調(diào)節(jié)魚類天然免疫發(fā)揮抗病毒的功能。

2.5 TRIM47

TRIM(The tripartite motif)家族的成員扮演著許多重要的角色，涉及許多細胞過程，如發(fā)育過程、腫瘤抑制、細胞周期調(diào)控和病毒反應[33]。TRIM 蛋白家族還調(diào)節(jié)NF-κB信號通路[34]。Wang等[35]證明了鯉TRIM47在抗病毒過程以及對IFN-I信號通路的調(diào)控起著重要的作用。qRT-PCR和Western blot結果表明，TRIM47在斑馬魚組織中廣泛存在，在腦部、肝和腎中高度表達，并且發(fā)現(xiàn)感染SVCV的鯉所有組織SVCV-G基因結果呈陽性，其中鰓、腎、脾和肝中TRIM47 mRNA水平呈下降趨勢，第7天恢復到正常水平。此外感染SVCV(MOI=0.1)胖頭魚(FHM)細胞內(nèi)的TRIM47 mRNA顯著下降，表達TRIM47重組質粒的FHM細胞感染SVCV后，發(fā)現(xiàn)SVCV-G基因轉錄水平明顯低于對照組，IFN-I表達上調(diào)。以上結果可推斷在正常情況下TRIM47在組織細胞內(nèi)廣泛存在并維持一定的水平，當?shù)挚筍VCV病毒感染時，降低自身轉錄水平，以調(diào)節(jié)相關細胞因子，引起IFN-I的上調(diào)，激活魚類天然免疫過程。

圖1 RLR 介導的信號通路及其調(diào)節(jié)作用[36]

3 干擾素誘導的魚類Mx蛋白

抗黏液病毒基因蛋白(Mx)是IFN誘導蛋白家族成員之一，當病毒入侵機體和細胞時，刺激干擾素表達，干擾素進一步誘導Mx蛋白和其他蛋白表達，一起構成細胞的抗病毒狀態(tài)，起到抑制病毒作用。B?rre等[39]通過系統(tǒng)發(fā)育對大西洋鮭基因組進行分析，定位于3條染色體的9個Mx基因。重組IFN刺激細胞系表達Mx基因，顯示染色體12中的Mx基因對I型IFN的反應比對II型IFN(IFNγ)的反應更強，而染色體25中的Mx基因對IFNγ的反應比對I型IFN的反應更強。Mx蛋白嚴格依賴于IFN-I表達，通過中樞連接結構域(CID)和C端的亮氨酸拉鏈結構域結合病毒核衣殼樣結構，發(fā)揮抗病毒功能[40]。該分子抗病毒功能首先由Jean Lindenmann在研究小鼠對流感病毒的先天免疫中發(fā)現(xiàn)[41-42]，Xiao等[43]進一步研究魚類Mx的功能，克隆和表達青魚Mx1(bcMx1)基因，發(fā)現(xiàn)bcMx1同樣具有抗病毒的能力。使用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)青魚組織中鰓中Mx1 mRNA含量遠高于其他組織，感染SVCV后，鰓中bcMx mRNA下降。MPF細胞感染不同濃度SVCV后，q-RT-PCR檢測，除了2 h(MOI=0.01)外Mx mRNA水平降低，其他組都表達上調(diào)，最高為133倍(72 h，MOI=0.01)。轉染表達bcMx1的質粒EPC細胞顯示出抗SVCV活性，CPE程度和細胞上清病毒滴度降低。綜上，魚類Mx蛋白具有抗病毒的能力，當SVCV入侵時，在細胞質內(nèi)IFN-I表達上調(diào)，激活Mx基因的表達，參與抗病毒免疫過程。

4 展 望

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，人們對養(yǎng)殖過程出現(xiàn)的疾病的防治越來越重視，SVCV作為魚類水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的病原體，研究宿主對SVCV的防御機制勢在必行。RLRs信號通路作為天然免疫應答中的重要組成部分，在維持機體穩(wěn)態(tài)平衡，激活天然免疫應答中發(fā)揮重要作用。天然免疫作為機體防御的最重要屏障，其研究已取得諸多進展。隨著對天然免疫信號通路的深入研究，天然免疫應答對于入侵宿主病毒的抗病毒應答也有了突破性進展尤其在抑制病毒方面。從2004年RLRs被發(fā)現(xiàn)可以識別胞質內(nèi)病毒RNA，RLRs的分子結構及調(diào)控機制就受到了廣泛地研究。SVCV作為典型的RNA病毒，其感染有可能引發(fā)魚類IFN抗病毒反應；然而，SVCV感染激活哪種信號傳導途徑以啟動IFN應答仍有待研究。

近些年研究發(fā)現(xiàn)NLRs和RLRs在抗病毒信號傳導之間也有一些特殊的聯(lián)系，NLRs也同樣參加I型IFN調(diào)控，與MAVS作用活化IRF3，誘導干擾素的產(chǎn)生，增強宿主抗病毒狀態(tài)，但是怎樣作用于MAVS還需進一步研究?，F(xiàn)階段對于SVCV抗病毒免疫應答的報道還相對較少，所以研究SVCV的抗病毒天然免疫應答可以為SVCV的防治、SVCV疫苗的研發(fā)奠定基礎。除此之外，研究領域還可以擴展到SVCV基因調(diào)控，免疫逃避機制等，為SVCV的預防和控制提供新的策略。