秦朝陽， 蔣湘艷， 李夢瑤， 朱夢圓， 金海如

(浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321000)

隨著對紅曲菌活性代謝產物的深入研究，越來越多的紅曲菌產品開發(fā)為藥物或者醫(yī)療保健品。目前陸續(xù)有多種洛伐他汀類藥物上市，這種藥物具有降血脂功效，主要是抑制HMG-COA限速酶的活性，該還原酶活性如果被抑制，膽固醇合成所需要的前體物質就會阻斷，從而影響膽固醇的合成[1]。1987年，美國FDA(Food and Drug Administration)允許Lovastatina和Mecatoe藥品上市之后，Sinmvastatin、Pravastatin、血脂康等藥品相繼上市[2]。紅曲菌還有其他方面的作用，紅曲中含有的麥角固醇，在紫外線照射下發(fā)生光化學反應產生維生素D2，可作為防治幼兒佝僂病藥物的材料[3]。此外，隨著對GABA生物活性的研究，GABA的降血壓抗疲勞作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，使開發(fā)研究新的降血壓藥物成為可能[4]。雖然紅曲中已有較多的活性代謝產物被分離和鑒定，如淀粉酶、紅曲色素、洛伐他汀、γ-氨基丁酸、桔霉素等，但關于紅曲中的熒光代謝物的報道較少[5-8]。目前紅曲米中被發(fā)現(xiàn)的熒光物質主要是monasfluore A (MFA)、monasfluore B (MFB)，其作用是能夠抑制細胞凋亡，并且抑制肝癌細胞和肺癌細胞生長，可作為抗癌光敏劑，還具有降脂和抗氧化功能。鄭允權等研究表明MFA、MFB能夠預防和治療阿爾茨海默氏癥，能夠良好地抑制細胞凋亡，包括Aβ1-42細胞、神經細胞、正常人體的低毒細胞。MFA、MFB可用于抗癌光敏劑，對人體正常細胞毒性低副作用小[9-11]。研究表明MFA、MFB對肝癌細胞、肺癌細胞抑制作用較強，對二倍體細胞抑制作用較弱。MFA、MFB對肝癌細胞半抑制量分別是12.4 μg/mL和7.1 μg/mL；對肺癌細胞半抑制量分別為16.3 μg/mL和10.6 μg/mL[12]。MFB對細胞抑制效果明顯高于MFA，這可能與它們的側鏈結構不同有關，Yeh等[13]在小鼠體內分別測試了紅曲米和MFA、MFB的降脂和抗氧化功能，結果表明檢測指標都有所降低，但是MFA、MFB比紅曲米更有效；Paul等[14]發(fā)現(xiàn)MFA對于Hela和PC3細胞具有抗癌效果，MFA對于PC3細胞有更強的細胞毒性，對于Hela細胞毒性較弱，這些研究均表明MFA、MFB有較好的應用前景。金華地區(qū)紅曲資源豐富，而且很早便開始使用紅曲菌釀造黃酒，但是缺少對該地區(qū)紅曲菌產熒光物質的分離和鑒定的研究[20]。本研究對開發(fā)及利用紅曲菌具有重要研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌種 采自金華及其周邊地區(qū)的10種紅曲米。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200，蔗糖20，瓊脂粉20，pH自然；種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200，蔗糖20，pH自然；斜面培養(yǎng)基：蛋白胨15，麥芽糖50，瓊脂粉30，pH自然；發(fā)酵培養(yǎng)基：大米40。

1.1.3 試劑 MFA、MFB標準品 (自制)；乙腈 (色譜純)、甲醇 (分析純)、蔗糖 (分析純)、瓊脂粉(分析純)、蛋白胨(分析純)、麥芽糖 (分析純)、乙腈 (色譜純)、石油醚 (60～90 ℃，分析純)，均購自金華醫(yī)藥；薄層層析板采用G-254硅膠板，購自青島海洋化工廠分廠；柱層析硅膠 (化學純)， 購自青島譜科分離材料有限公司。

1.1.4 儀器與設備 EYELAN-1100旋轉蒸發(fā)儀，購自上海愛朗儀器有限公司；CCA-1111冷卻水循環(huán)裝置，購自上海愛朗儀器有限公司；SB25-12YDTD超聲波清洗器，購自寧波新芝生物科技股份有限公司；冷凍高速離心機，購自費默飛世爾科技 (中國) 有限公司；紫外可見分光光度計，購自上海美譜達儀器有限公司；LC 218制備型液相色譜儀、Agilent 1260型高效液相色譜儀、G 6230 AA高分辨飛行時間質譜儀，均購自美國Agilent公司；Triple TOF 4600超高效液相高分辨質譜聯(lián)用儀，購自日本島津-美國ABSciex。

1.2 方法

1.2.1 紅曲米樣品的提取 用攪拌機將紅曲米研碎，稱取0.25 kg研碎后的紅曲米放入1.0 L燒杯，加入0.5 L 95%乙醇，超聲提取30 min，過濾得濾液，殘渣用200 mL 95%乙醇提取2次，合并濾液，將濾液放在燒瓶中60 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮至無水殘留后，再加入V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(丙酮) = 8∶1∶1的混合液復溶，過濾，得到初提物，硅膠柱層析分離備用，通過薄層層析檢測提取效果[14]。

1.2.2 硅膠薄層層析分析 薄層層析板采用硅膠GF 254，切成5 cm×10 cm規(guī)格，用毛細管吸取紅曲米提取液在距離板下1 cm處點樣，分別采用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(丙酮)=15∶1∶1、10∶1∶1、8∶1∶1的展開劑展開20 min，層析結束后，取出薄板自然晾干，紫外燈 (λ=365 nm) 觀察，確定熒光物質所在部位，計算Rf值。

1.2.3 硅膠柱層析分離 稱取15～20 g硅膠,用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(丙酮)=15∶1∶1 浸泡，拌勻濕法裝柱，靜止壓實3 h后上樣，加入無水硫酸鈉防止樣品被展開劑沖破，而且吸收洗脫劑中少量的水分，依次用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(丙酮)=15∶1∶1、10∶1∶1、8∶1∶1洗脫。隨時用紫外燈監(jiān)控藍色熒光物質洗脫位置，待其洗脫至柱底后，分別接收洗脫液，40 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮得到濃縮物，并用薄層層析檢測濃縮物[15]。

1.2.4 用制備型液相色譜純化MFA、MFB 由硅膠柱分離到的熒光組分經有機濾膜過濾，進一步用制備型液相色譜純化，色譜柱：Agilent Prep-C18 (21.6 mm×250 mm；10 μm)；流動相采用甲醇∶水=70∶30的固定比例；柱溫控制在25 ℃；檢測波長380 nm；進樣量5 mL，流速為2.5 mL/min。

1.2.5 兩種藍色熒光物質的鑒定 ①HPLC (高效液相色譜)分析：用帶有熒光檢測器的HPLC對硅膠柱制備的兩種熒光物質進行純度檢測，色譜條件：流動相A為乙腈 (色譜純)，B為純水，流動相分別用0.45 μm有機相濾膜和水相濾膜過濾，選用Thermo C18 (4.6 mm×250 mm；50 μm) 色譜柱；A∶B = 77%∶23%，檢測波長λex=396 nm，λem=460 nm；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。②ESI-HRMS (高分辨飛行時間質譜儀)分析：將制備的兩種藍色熒光物質溶于甲醇，采用高分辨飛行時間質譜儀分析，并用分析軟件檢索分析其分子量，推導出化合物C、H、O和N等元素情況，質譜條件：ESI電離源，正離子模式。③ESI-MS/MS (電噴霧二級串聯(lián)質譜)分析：將做完ESI-HRMS的樣品再進行ESI - MS/MS檢測，使用ESI正離子源電離。

1.2.6 紅曲菌的分離純化 將不同樣品紅曲米研碎過100目篩，準確稱取2.0 g紅曲米粉加入10 mL無菌水中，制成原液，將原液作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋并涂布于PDA平板，30 ℃培養(yǎng)1周左右[16]。根據(jù)平板上菌落長勢情況，挑選不同的純的菌落劃線培養(yǎng)，直至出現(xiàn)單菌落[17]，將所得菌株編號，轉接在斜面培養(yǎng)基上4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 紅曲米的制備 ①固態(tài)發(fā)酵生產紅曲米：大米 → 浸泡過夜 → 清洗→ 滅菌 → 冷卻至室溫 → 接種種子液 → 固體培養(yǎng) → 紅曲米 → 測MFA、MFB含量。②種子液制備：在超凈工作臺上，用接種環(huán)挑取兩環(huán)菌株，接種到裝有50 mL培養(yǎng)基的三角瓶中，130 r/min，30 ℃搖床培養(yǎng)，直到培養(yǎng)基變紅，得到種子液。③大米的處理：將大米裝入1 L燒杯，自來水洗滌2～ 3次，浸泡過夜，40目篩瀝干，稱取40 g分裝于250 mL的錐形瓶。121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫，待接種。④大米發(fā)酵[18]：在超凈工作臺里將滅菌的大米振蕩松散，用已滅菌消毒的移液槍分別加入10% (質量分數(shù)) 的種子液，充分搖勻，30 ℃培養(yǎng)，發(fā)酵4 d后，每瓶補無菌水一次，振蕩搖勻，共發(fā)酵12 d。

1.2.8 紅曲米中兩種熒光物質(MFA、MFB) 的HPLC定量測定 ①MFA、MFB標準溶液配置：用甲醇配制成10 、20、30、40 mg/L的MFA、MFB標準溶液。以峰面積 (A) 為縱坐標，質量濃度 (mg/L) 為橫坐標，得到MFA標準曲線：y = 45.731x-8.445 6，R2=0.995 8；MFB標準曲線：y=41.209x-49.379，R2=0.989 5。②紅曲米樣品的提取：將發(fā)酵的紅曲米研碎，稱取0.5 g放入10 mL離心管，加入5 mL甲醇，超聲波提取30 min，自然澄清，過濾得到上清液，將殘渣用同樣方法提取2次，合并上清液，取一定量上清液過0.45 μm濾膜，待檢測。③色譜條件：色譜柱：Thermo C18 (4.6 mm×250 mm；5 μm) ；柱溫25 ℃；流動相:V(乙腈)∶V(水)=77∶23；檢測器：熒光檢測器 (λex=396 nm，λem=460 nm) ；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

1.2.9 高產MFA、MFB菌株的分子生物學鑒定 將純化的紅曲菌落平板寄往上海生工生物工程股份有限公司進行測序。測序結果在GenBank中進行核酸序列比對，分析ITS序列同源性，利用MEGA 5軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定目的菌株的種類以及其分類地位。

2 結果與分析

2.1 紅曲米樣品熒光物質的提取

將0.25 kg紅曲米粉溶于95%的乙醇中提取30 min，通過薄層層析檢測濾液，發(fā)現(xiàn)兩種熒光物質被提取出來，紅曲米殘渣中兩種熒光物質的含量還很高，繼續(xù)用95%乙醇提取2～3次，大部分的熒光物質被提取，提取液進行柱層析。

2.2 熒光物質的薄層層析分離

采用極性從小到大的展開劑(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(丙酮)=15∶1∶1、10∶1∶1、8∶1∶1)分離熒光物質，當極性為15∶1∶1時兩種熒光物質分離效果不是很好，使用較大極性的8∶1∶1的溶液作為展開劑，可以使熒光物質很好地分離，點樣量會影響條帶的清晰程度，當點樣量過大時硅膠板上的條帶變寬，兩種熒光物質斑點界線不明顯，點樣量過小條帶不清楚，當點樣量為0.5 mg時，兩種熒光物質分離效果明顯。如圖1A所示，第一個熒光物質組分的Rf=0.5，第二個熒光組分的Rf=0.28。

圖1 紅曲米提取液中熒光物質的薄層層析圖

2.3 硅膠柱層析純化兩種熒光物質

洗脫液極性對分離效果影響較大，故沒有采用單一極性的洗脫液。本研究采用不斷改變極性的洗脫液V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(丙酮)=15∶1∶1、10∶1∶1、8∶1∶1洗脫熒光物質，洗脫順序依次為黃色素、第一種熒光物質、黃色素、第二種熒光物質，順序與硅膠板的條帶一致。當用小極性洗脫液洗脫時各種成分分離較慢，各種成分已經分開但不明顯，為此采用極性大的洗脫液，使各種成分徹底分開。收集兩組熒光組分，通過薄層層析對兩組熒光物質進行純度分析，如圖1B所示，結果表明兩種熒光物質沒能徹底分開，故還須分離純化。

2.4 制備型色譜儀分離純化熒光物質

用制備型液相色譜儀進一步分離純化兩種熒光物質，收集12.1 min和24.6 min的洗脫峰位置。兩組熒光組分在365 nm紫外燈照射下能夠產生藍色熒光 (圖2) 。然后在旋轉蒸發(fā)儀上蒸發(fā)掉多余的液體，得到純化的兩種熒光物質，為黃色油狀物。將所得兩種熒光物質經HPLC純度分析，用于結構鑒定。

圖2 不同光照下熒光物質

2.5 HPLC分析熒光物質

用帶有熒光檢測器的HPLC檢測所制得的兩種熒光物質，結果如圖3所示。制備的兩種熒光物質在保留時間2 min左右都含有少量雜質峰，但是不影響檢測結果。第一種熒光物質出峰時間為6.72 min，峰形好，檢測信號強，雜質少。第二種熒光物質的出峰時間為11.02 min，檢測效果好，兩種熒光物質純度均較高。

圖3 MFA、MFB標準品色譜圖

2.6 ESI-HRMS 分析熒光物質

ESI是一種使用較為普遍的電離方式，即便是相對分子質量大，穩(wěn)定性差的化合物，也不會在電離過程中發(fā)生分解，其最大特點是能夠形成多電荷離子，為研究天然化合物提供一種簡單快捷靈敏的檢測方法。高分辨率質譜是一種有高分辨能力的新型質譜儀，不僅可以對已知物質進行鑒定，還能對未知物精確測定其由C、H、O、N、S組成比例。如圖4A所示，m/z = 357.172 1為化合物的[M+H]+離子峰，m/z = 379.153 9為化合物[M+Na]+準離子峰。從圖4B可知，m/z = 385.203 9為另一種化合物的[M+H]+準分子離子峰，m/z = 407.185 9為化合物[M+Na]+準離子峰。由表1可以看出，兩種熒光物質的分子量分別為356、384，計算出分子式為C21H24O5、C23H28O5。兩者分子量相差28，后者可能比前者碳鏈長度多了一個[-CH2CH2-]基團。

圖4 兩種熒光物質的高分辨率質譜圖

表1 兩種熒光物質的HRMS分析

2.7 ESI-MS/MS分析熒光物質

采用ESI-MS/MS分析兩種熒光物質樣品，結果如圖5所示，第一種基峰357.169 6為[M+H]+，第二種基峰385.201 5為[M+H]+，與高分辨飛行時間質譜儀分析結果一致，通過對兩種物質基峰的二級質譜分析，第一種熒光物質出現(xiàn)了285.183 3、241.087 8、185.095 8、172.087 5等碎片離子峰，第二種熒光物質出現(xiàn)了313.216 4、259.097 0、241.086 8、185.097 2、172.089 1等離子峰。這與文獻[19]報道一致，將化合物1鑒定為monasfluore A (MFA)，將化合物2鑒定為monasfluore B (MFB) 。結構式如圖6所示。

2.8 不同紅曲菌發(fā)酵紅曲米的MFA、MFB含量

由圖3可知，MFA、MFB標準品的保留時間分別為6.769 min、11.024 min，雜峰較少，雜峰面積小，不影響檢測結果，標準品峰形好，說明此方法可以較好地檢測出紅曲米中MFA、MFB的含量。檢測結果如表3，不同紅曲菌發(fā)酵的紅曲米MFA、MFB含量差別很大，其中菌株YKLSZ的MFA、MFB含量最低分別僅為0.29 g/kg、1.41 g/kg。菌株WZWZ的MFA、MFB含量最高分別可達3.63 g/kg、7.29 g/kg，篩選出MFA、MFB產量高的菌株WZWZ。

圖6 MFA和MFB的化學結構式

表3 不同紅曲菌發(fā)酵后大米中MFA和MFB的含量

注：MFA、MFB含量為3次測定的平均值，差異顯著性經Duncan′s新復極差法檢驗，不同字母表示在P≤0.05水平上差異顯著性

2.9 高產MFA、MFB紅曲菌株的分子鑒定

將上海生工測序得到的堿基序列，按照1.2.9的方法進行鑒定，最終將WZWZ菌株鑒定為紫色紅曲霉 (Monascuspurpureus)。

3 討 論

本研究得到兩種熒光物質MFA、MFB，通過高分辨質譜計算出分子式為C21H24O5、C23H28O5。兩者分子量相差28，后者可能比前者碳鏈長度多了一個[-CH2CH2-]基團。鄭允權等[9]研究表明MFA、MFB能夠預防和治療阿爾茨海默氏癥，能夠良好地抑制細胞凋亡，包括Aβ1-42細胞、神經細胞等。不同紅曲菌株產MFA、MFB能力有很大不同，黃志兵等[14]利用電噴霧質譜等方法研究了這兩種化合物的結構并得到它們的化學式，與本研究基本一致。不同的是其實驗篩選得到的紅曲菌產MFA、MFB最高為81.4 g/kg、26.3 g/kg，而本研究篩選到的一些紅曲菌MFA產量最高僅為3.63 g/kg，MFB產量最高僅為7.29 g/kg，可能是由于氣候、地區(qū)與菌種不同，具體原因有待研究。國內外文獻尚未對提高紅曲米中熒光物質的產量做進一步探索，有必要采用誘變及基因工程等手段提高熒光物質產量。