邢慶洋， 付俁蕭， 黃 旭， 呂 童， 馮 輝， 曹雅明

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122)

IL-33屬于IL-1細(xì)胞因子家族成員，因其在穩(wěn)態(tài)和炎癥中的雙重作用而受到廣泛關(guān)注[1]。IL-33既可在細(xì)胞外發(fā)揮傳統(tǒng)細(xì)胞因子的調(diào)控作用，亦可作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達[2]。IL-33及其受體ST2(suppression of tumorigenicity 2)已被證實參與固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)[3]。 瘧疾感染誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列促炎、抑炎細(xì)胞因子和趨化因子，其分泌的時效和程度與瘧原蟲負(fù)荷、感染進程和疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，重癥瘧疾患兒血漿IL-33水平明顯升高，提示內(nèi)源性IL-33與瘧疾嚴(yán)重性相關(guān)[6]。PlasmodiumbergheiANKA(PbA)感染小鼠腦瘧發(fā)生時，腦組織內(nèi)IL-33表達上調(diào)，相比ST2-/-小鼠腦瘧癥狀得到明顯改善，提示內(nèi)源性IL-33信號參與實驗性中樞腦瘧(experimental cerebral malaria，ECM)發(fā)生[7]。然而，另有研究顯示外源重組IL-33對PbA感染小鼠有保護作用。IL-33通過降低炎癥因子IFN-γ、IL-12和TNF-α的產(chǎn)生阻止ECM發(fā)生[8]。鑒于IL-33在瘧疾感染中的雙重作用，本研究采用致死型約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii17XL，P.y17XL)感染BALB/c小鼠模型，探討重組IL-33治療對瘧疾感染宿主組織局部細(xì)胞因子表達的影響，進而闡述外源性IL-33在瘧疾感染中的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗小鼠 SPF級BALB/c小鼠(8～10周，18～22 g，雌性)，購自北京維通利華公司。

1.1.2 試劑與儀器 致死型約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii17XL，P.y17XL)由中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室液氮保種；重組小鼠IL-33(Biolegend，美國)；M-PER?蛋白裂解液(Thermo Fisher Scientific，美國)；ProcartaPlex?小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子(9 plex)免疫檢測試劑盒(Ebioscience，美國),包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-13、IL-6、IL-18、IFN-γ和TNF-α；ProcartaPlex?小鼠趨化因子(9 plex)免疫檢測試劑盒(Ebioscience，美國)，包括CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)、CCL5(RANTES)、CCL11(Eotaxin)、CCL21(MIP-2)、CCL7(MCP-3)、CXCL10(IP-10)和GRO-α(CXCL1)；酶標(biāo)儀購自BIO-TEK公司；離心機購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗?zāi)Ｐ徒?液氮保種P.y17XL 感染紅細(xì)胞復(fù)蘇后，腹腔感染BALB/c小鼠(0.1 mL/只，i.p.)。待原蟲血癥達10%左右，小鼠麻醉狀態(tài)下心臟采血EDTA抗凝，獲取新鮮P.y17XL 感染紅細(xì)胞。1×106P.y17XL 感染紅細(xì)胞腹腔感染BALB/c小鼠(0.1 mL/只，i.p.)。尾靜脈血涂片Griemsa染色，計數(shù)原蟲血癥。

1.2.2 IL-33腹腔注射 重組IL-33粉末用PBS溶解，每只小鼠按0.2 μg腹腔注射20 μL，連續(xù)給藥5 d。重組小鼠IL-33粉末PBS溶解10 μg/mL，0.2 μg/只/200 μL/感染后0 d開始腹腔注射，連續(xù)注射5 d。對照組注射同等劑量PBS。

1.2.3 脾細(xì)胞培養(yǎng) 無菌獲取脾臟，研磨組織獲取細(xì)胞懸液。離心后獲得脾細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液4 ℃裂解細(xì)胞3～5 min，PBS洗細(xì)胞1次。離心獲取脾細(xì)胞，定容后計數(shù)脾細(xì)胞總數(shù)。M-PER?蛋白裂解液加蛋白酶抑制劑裂解pRBC，獲取瘧原蟲全蟲蛋白。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板10 mg/mL全蟲蛋白4 ℃包板過夜，次日無菌接種脾細(xì)胞，5% CO2無菌37 ℃培養(yǎng)72 h。收集樣本，4 ℃ 1 000×g離心10 min，取上清分裝，-80 ℃凍存待用。

1.2.4 多因子免疫檢測 血清樣本和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清使用前，4 ℃ 10 000×g離心10 min，取上清。96孔板每孔加入50 μL預(yù)混抗體磁珠，放置在手持式磁力板上。150 μL洗脫buffer洗磁珠1次，去掉磁力板。每孔加入樣本稀釋液(25 μL/孔)，再加入血清樣本(25 μL/孔)、培養(yǎng)上清樣本(50 μL/孔)及標(biāo)本品(25 μL/孔或50 μL/孔)。密封板后室溫500 r/min震蕩2 h，洗脫3次，加入檢測抗體(25 μL/孔)，密封板后室溫500 r/min震蕩30 min。洗脫3次，加入鏈霉親和素-PE(50 μL/孔)，密封板后室溫500 r/min震蕩30 min。洗脫3次，每孔加入120 μL檢測buffer，密封板后室溫500 r/min震蕩5 min。Luminex?200上機檢測。ProcartaPlex Analyst 1.0軟件分析多因子數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 IL-33給藥組和對照組原蟲血癥水平

P.y17XL 感染小鼠感染后3 d外周血可見瘧原蟲感染紅細(xì)胞。隨后，原蟲血癥水平快速上升，在感染后7 d，感染率達到峰值。與對照組相比，IL-33給藥組小鼠原蟲血癥上升緩慢。感染0～5 d，IL-33給藥組原蟲血癥水平控制在20%以內(nèi)。IL-33給藥組原蟲血癥峰值比對照組延遲出現(xiàn)(圖1)。

圖1 IL-33給藥組和對照組原蟲血癥水平

2.2 IL-33給藥組和對照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清Th1型細(xì)胞因子表達水平

感染3 d和5 d，P.y17XL 感染小鼠IL-33給藥組和對照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清3種Th1型細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示，對照組IFN-γ表達水平明顯增加(P<0.05，5 d vs 3 d)，IL-18在感染后5 d出現(xiàn)明顯降低(P<0.01，5 d vs 3 d)。IL-2表達持續(xù)處于低水平。與對照組相比，IL-33給藥組IFN-γ在感染后3 d或5 d均出現(xiàn)明顯降低(P<0.01)，IL-18表達明顯降低(P<0.05)。在感染5 d，IL-33給藥組IL-2和IL-18水平明顯低于感染3 d(P<0.05)(圖2)。

2.3 IL-33給藥組和對照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清Th2型細(xì)胞因子表達水平

感染3 d和5 d，P.y17XL 感染小鼠IL-33給藥組和對照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清3種Th2型細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示，對照組IL-4、IL-5和IL-13在感染后5 d明顯降低(P<0.05，5 d vs 3 d)。與對照組相比，IL-33給藥組IL-5在感染后3 d和5 d均明顯升高(P<0.05)。IL-13在感染后5 d較對照組明顯增加(P<0.05)，但比感染后3 d有所降低(P<0.05)(圖3)。

圖2 IL-33給藥組和對照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清Th1型細(xì)胞因子表達水平

圖3 IL-33給藥組和對照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清Th2型細(xì)胞因子表達水平

2.4 IL-33給藥組和對照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清前炎性細(xì)胞因子表達水平

感染3 d和5 d，P.y17XL 感染小鼠IL-33給藥組和對照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清3種前炎性細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示，與感染后3 d相比，對照組IL-6水平在感染5 d表達明顯升高(P<0.05，5 d vs 3 d)。與對照組相比，IL-33給藥組IL-6水平在感染3 d和5 d均明顯降低(P<0.01)。TNF-α在感染3 d較對照組明顯降低(P<0.01)。IL-1β在兩組間無明顯差別(圖4)。

圖4 IL-33給藥組和對照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清前炎性細(xì)胞因子表達水平

2.5 IL-33給藥組和對照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清趨化因子表達水平

感染3 d和5 d，P.y17XL 感染小鼠IL-33給藥組和對照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清趨化因子檢測結(jié)果顯示，與感染3 d相比，對照組RANTES和IP-10表達水平在感染5 d明顯下降(P<0.05，5 d vs 3 d)。與對照組相比，IL-33給藥組GRO-α、RANTES在感染3 d均明顯降低(P<0.01，P<0.05)，IP-10差異無統(tǒng)計學(xué)意義。感染5 d，IL-33給藥組GRO-α較對照組明顯下降(P<0.01)。IL-33給藥組組內(nèi)，感染5 d與3 d相比，RANTES有明顯上調(diào)(P<0.05)，IP-10明顯降低(P<0.05)(圖5)。

2.6 IL-33給藥組和對照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清巨噬細(xì)胞相關(guān)趨化因子表達水平

感染3 d和5 d，P.y17XL 感染小鼠IL-33給藥組和對照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清趨化因子檢測結(jié)果顯示，與感染3 d相比，對照組MIP-1α表達在感染5 d明顯升高(P<0.05，5 d vs 3 d)，MIP-1β和MCP-3表達明顯降低(P<0.05)。與對照組相比，IL-33給藥組MIP-1α、MIP-1β在感染5 d均明顯降低(P<0.01，P<0.05)，MCP-1和MCP-3無明顯差異。IL-33給藥組組內(nèi)，感染5 d與3 d相比，MCP-3有明顯下降(P<0.05)，Eotaxin和MIP-2幾乎無檢出(圖6)。

圖5 IL-33給藥組和對照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清趨化因子表達水平

圖6 IL-33給藥組和對照組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清趨化因子表達水平

3 討 論

IL-33主要由組織細(xì)胞如上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞合成[9]。在穩(wěn)態(tài)狀態(tài)下，IL-33不被細(xì)胞主動分泌。在炎癥條件下，IL-33在肥大細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)表達[10]。細(xì)胞損傷或死亡是IL-33到達細(xì)胞外環(huán)境的主要機制。因此，IL-33作為警報素是免疫系統(tǒng)的重要的早期預(yù)警[11]。

研究證實，IL-33以全長分子形式(IL-33FL)發(fā)揮生物學(xué)活性，通過ST2依賴方式誘導(dǎo)靶細(xì)胞NFκB活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生[12-13]?？寡x感染中IL-33可促進嗜酸性粒細(xì)胞合成IL-13[14]。ST2+記憶Th2細(xì)胞(mTh2)以IL-33依賴方式抑制蠕蟲的生殖能力，通過表達IL-5在肺部募集高表達堿性蛋白(MBP)的嗜酸性粒細(xì)胞發(fā)揮抗蠕蟲感染作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，重組IL-33對P.y17XL 感染中多種趨化因子表達下調(diào)，其中MIP-1α/β和GRO-α主要趨化單核、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，而RANTES對活化T細(xì)胞有趨化效應(yīng)。與此同時，重組IL-33治療P.y17XL 感染小鼠后脾細(xì)胞分泌前炎癥細(xì)胞因子IFN-γ、IL-6和TNF-α水平明顯降低。由此表明，重組IL-33在P.y17XL 感染過程中通過調(diào)控趨化因子表達，減少前炎癥細(xì)胞浸潤進而降低前炎癥細(xì)胞因子表達。

IL-33靶向細(xì)胞主要是組成性表達ST2的組織駐留免疫細(xì)胞，如肥大細(xì)胞、II型固有樣淋巴細(xì)胞(innnate lymphoid cells，ILC2)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)。外源性IL-33促進Pb感染小鼠ILC2擴增、M2巨噬細(xì)胞極化和Treg細(xì)胞功能增強[8]。在鉤蟲感染IL-33-/-小鼠中，分泌IL-13的ILC2選擇性缺失，嗜酸性粒細(xì)胞募集降低，進而不利于蟲體的清除[16]。夏氏瘧原蟲(PlasmodiumchabaudiAS，Pc AS)感染IL-13-/-和ST2-/-小鼠實驗結(jié)果提示，IL-33/ST2通過產(chǎn)生IL-13誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生TNF-α和IL-6等促炎因子，參與PcAS感染的肝臟炎癥性損傷[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，重組IL-33治療P.y17XL 感染小鼠后脾細(xì)胞分泌IL-5水平明顯增加而IL-13變化不明顯。嗜酸性粒細(xì)胞是主要的IL-5Rα表達細(xì)胞，IL-5是組織中嗜酸性粒細(xì)胞聚集的主要調(diào)節(jié)因子[18]。嗜酸性粒細(xì)胞通過釋放細(xì)胞毒性蛋白參與抗寄生蟲感染[19]。本研究結(jié)果提示，重組IL-33通過上調(diào)IL-5表達水平，增強嗜酸性粒細(xì)胞活性進而發(fā)揮控制P.y17XL原蟲增殖的作用。

寄生蟲感染中細(xì)胞因子和趨化因子表達譜與原蟲負(fù)荷的相關(guān)性研究是寄生蟲感染替代標(biāo)志物的另一種篩查手段[20]，促炎和抑炎因子之間的平衡與瘧疾低發(fā)病率相關(guān)[21]。本研究采用多因子檢測手段，通過對瘧原蟲感染狀態(tài)下脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的多種細(xì)胞因子和趨化因子進行綜合分析，明晰了P.y17XL 感染急性期以炎癥性細(xì)胞因子和Th1型細(xì)胞因子應(yīng)答為主。重組IL-33治療可促進IL-5為主的Th2型應(yīng)答，進而降低Th1和前炎癥應(yīng)答效應(yīng)，減少炎癥損傷。

IL-33在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和組織應(yīng)答中具有多重作用，其在日益增多的疾病中的作用越來越受到關(guān)注。有關(guān)IL-33在體內(nèi)的生物活性形式，以及如何進入靶細(xì)胞產(chǎn)生局部效應(yīng)或全身性作用尚有待深入研究。隨著對IL-33在健康與疾病中的作用方式、調(diào)節(jié)機制和功能的全面了解，以期對包括瘧疾在內(nèi)的感染性診斷、治療和預(yù)防提供指導(dǎo)與幫助。