楊麗玉， 劉嬋娟， 楊詩怡， 王菁妍， 羅 勤

(華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430079)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，以下簡稱Lm)是一種人畜共患的革蘭陽性致病菌，可以穿透人體的三大屏障—道屏障、血腦屏障和胎盤屏障[1]，造成人體感染，嚴(yán)重的可導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)，死亡率達(dá)20%～30%，曾被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為21世紀(jì)四大食源性致病菌之一[2-3]。因此，充分利用各種模型系統(tǒng)，深入研究Lm致病機(jī)制將為預(yù)防和治療李斯特菌病提供重要的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。Lm致病能力的高低與其毒力基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)，由prfA、hly、plcA、actA、mpl和plcB組成的Lm毒力基因島，在Lm發(fā)揮致病作用中起著至關(guān)重要的作用[1]。毒力基因島上基因的表達(dá)均直接或間接地受PrfA的調(diào)控。PrfA蛋白由prfA基因編碼，缺失prfA將會(huì)導(dǎo)致Lm致病能力的極大降低。PrfA屬于轉(zhuǎn)錄活化因子Crp/Fnr家族中的一員[4]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PrfA蛋白的第145位甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸時(shí)就會(huì)導(dǎo)致該蛋白組成型表達(dá)(通常以PrfA*表示)。由于這種組成型表達(dá)蛋白不受環(huán)境因素變化的影響而一直處于高量表達(dá)狀態(tài)，導(dǎo)致攜帶有PrfA*菌株的毒力高于其他菌株[5]，因此PrfA*常被用作檢驗(yàn)和比較李斯特菌對宿主致病能力的參照。近年來，由于昆蟲的操作便利性、培養(yǎng)的低成本以及道德上的可接受性等特點(diǎn)，特別是其雖只具有天然免疫系統(tǒng)，但與哺乳動(dòng)物在進(jìn)化上的保守性，利用適宜的昆蟲作為研究人類疾病致病機(jī)制的模型系統(tǒng)已被廣為接受。Mansfield等[6]在2003年已報(bào)道了利用黑腹果蠅作為探索Lm致病機(jī)制以及宿主對Lm免疫反應(yīng)的模式生物；2010年Mukherjee等[7]發(fā)現(xiàn)不同毒力的Lm在侵染大蠟螟幼蟲后，可造成幼蟲不同程度的損傷和死亡。而且，大蠟螟可在37 ℃下生長和繁殖，此溫度條件對于模擬Lm侵染人體后毒力因子的表達(dá)是最為適宜的溫度[8-9]。盡管如此，大蠟螟作為研究人類病原菌致病機(jī)制的模型系統(tǒng)仍有一些不足。首先，大蠟螟全基因組序列尚未公布，這對于研究病原菌與宿主的互相作用存在較大的限制；其次，已報(bào)道的文獻(xiàn)中大多數(shù)是選擇大蠟螟幼蟲最后一個(gè)齡期注射病原菌，該齡期幼蟲蟲體一般長約20 mm，重約250 mg，大小適合人工注射和采集蟲體組織用于免疫組化等研究[7]，但最后一期幼蟲面臨變態(tài)成蛹，注射培養(yǎng)幾天后的病理反應(yīng)往往受到變態(tài)反應(yīng)的干擾，尤其是觀察幼蟲中腸細(xì)胞的形態(tài)時(shí)，遇到的問題最為突出。棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera(Hübner))廣泛分布在中國及世界各地，是棉花蕾鈴期重要的鉆蛀性害蟲[10]。棉鈴蟲和大蠟螟一樣，同屬于鱗翅目，但棉鈴蟲相較于大蠟螟，不僅各蟲態(tài)經(jīng)歷的時(shí)間短(棉鈴蟲完成一個(gè)世代所需時(shí)間大約是大蠟螟的一半)，而且幼蟲形體較大。棉鈴蟲4齡幼蟲的長度(20～23 mm)和體重(180～230 mg)已達(dá)到大蠟螟幼蟲最后一個(gè)齡期的長度和體重，不但便于精準(zhǔn)注射，而且易于收集蟲體內(nèi)血淋巴、脂肪體和一些其他組織。同時(shí)，由于4齡棉鈴蟲不是最后一個(gè)齡期，在觀察蟲體中腸細(xì)胞的病理變化時(shí)，不容易受到變態(tài)反應(yīng)的干擾，對病原菌的侵染也較為敏感。更為欣喜的是，棉鈴蟲的全基因組序列已在2017年公布[11]。但迄今為止，尚未有棉鈴蟲作為研究人類病原菌致病機(jī)制的模型系統(tǒng)的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究探索利用容易獲取、飼養(yǎng)方便且能在短時(shí)間內(nèi)獲取結(jié)果的棉鈴蟲4齡幼蟲作為探究Lm致病機(jī)制的昆蟲模型，以期為進(jìn)一步研究Lm與宿主的相互作用機(jī)制提供參考。本研究用Lm野生株(EGDe，中毒)和PrfA缺失株(EGDeΔprfA，弱毒)、以及PrfA組成型高表達(dá)株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*，高毒)注射棉鈴蟲4齡幼蟲，通過檢測不同毒力的Lm菌株對棉鈴蟲幼蟲的半數(shù)致死量、全蟲及體內(nèi)不同部分(腸道、血淋巴、體液)的載菌量，觀察棉鈴蟲中腸病理變化，以及感染不同毒力的Lm對血細(xì)胞包囊作用和數(shù)目的影響，探究棉鈴蟲是否適合作為研究Lm致病機(jī)制的昆蟲模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和昆蟲 選用個(gè)體大小一致、生長發(fā)育同步的4齡棉鈴蟲幼蟲(購自河南科云生物科技有限公司)。在溫度(27±1) ℃，相對濕度(RH)65%～75%，光周期14 L∶10 D條件下飼養(yǎng)[12]。所用菌株EGDe和質(zhì)粒pERL3為德國維爾茨堡大學(xué)Werner Gobel教授惠贈(zèng)，EGDeΔprfA和EGDeΔprfA+pERL3-prfA*為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。

1.1.2 主要試劑 BHI(Brain Heart Infusion，購自B&D 公司)；苦味酸混合固定液(購自湖北百奧斯生物科技有限公司)；Sephadex DEAE A-25色譜珠(購自Biosharp)；抗凝劑：NaCl(國藥)1.81 g、檸檬酸鈉(國藥)4.41 g、葡萄糖(Sigma)9.9 g、檸檬酸(國藥)2.73 g、EDTA(武漢飛揚(yáng)生物)1.86 g，加入蒸餾水500 mL定容；李斯特菌顯色培養(yǎng)基(購自青島海博生物技術(shù)有限公司)；引物由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司(武漢)合成。

1.1.3 儀器與設(shè)備 六孔板(6孔，購自無錫耐思生物科技有限公司)；人工氣候箱(HP300GS-C，購自武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)；倒置顯微鏡(COIC XDS-1B，購自重慶光電儀器有限公司)；微量進(jìn)樣器(10 μL,購自上海高鴿工貿(mào)有限公司)；解剖鏡(SOPTOP，購自寧波舜宇儀器有限公司)；本研究病理切片由湖北百奧斯生物科技有限公司制作。

1.2 方法

1.2.1 不同毒力Lm生長曲線及生長形態(tài)的測定 將待測菌株過夜活化，次日按照1∶100轉(zhuǎn)接入新鮮的BHI培養(yǎng)基中，混勻后測定菌液在600 nm處的吸光度值(OD600)，記為0 h的值，180 r/min震蕩培養(yǎng)，每隔1 h檢測菌液OD600的變化，直到細(xì)菌生長至穩(wěn)定期。與此同時(shí)，在指定時(shí)期取0.1 mL菌液適當(dāng)稀釋后涂布平板，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后拍照并計(jì)數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 棉鈴蟲半數(shù)致死量LD50的測定 選取生理狀態(tài)基本一致的4齡棉鈴蟲幼蟲置于冰上麻醉2 h待用。培養(yǎng)至108cfu/ml時(shí)，用BHI進(jìn)行5倍梯度稀釋，稀釋為5個(gè)濃度(50、51、52、53、54倍)后，用微量進(jìn)樣器分別吸取稀釋后的菌液5 μL，自棉鈴蟲第一腹足注入。每個(gè)濃度各注射18條棉鈴蟲，以注射5 μL BHI的棉鈴蟲為對照。注射后的棉鈴蟲幼蟲置于六孔板中，放入人工氣候培養(yǎng)箱中繼續(xù)飼養(yǎng)。分別在24、48和72 h統(tǒng)計(jì)棉鈴蟲幼蟲的死亡數(shù)量(幼蟲在觸摸時(shí)無任何反應(yīng)時(shí)被認(rèn)為已死亡)，計(jì)算死亡率，按照周一平[13]的方法，采用SPSS17.0軟件計(jì)算細(xì)菌對棉鈴蟲的半數(shù)致死量LD50。

1.2.3 棉鈴蟲中腸病理切片的制備和觀察 選取感染癥狀明顯的棉鈴蟲幼蟲，用無菌剪刀剪開第三頭足到第四腹足部分，取出中腸，用苦味酸混合固定液充分固定24 h后水洗。經(jīng)過脫水、浸蠟、包埋一系列工序后，進(jìn)行切片、展片、撈片、烤片和脫蠟，最后進(jìn)行HE(蘇木精-伊紅染色法，Hematoxylin-Eosin staining)染色。所得病理切片置于倒置顯微鏡下觀察(10×和40×)，拍照記錄。

1.2.4 單核細(xì)胞增生李斯特菌對棉鈴蟲血細(xì)胞包囊作用的影響 參照Ling等[14]的方法進(jìn)行體內(nèi)包囊測定。Sephadex DEAE A-25色譜珠用作包囊目標(biāo)。為了便于觀測珠子在蟲體的包囊程度，色譜珠事先用0.1%剛果紅染色2 h，UV光下干燥后，重懸于0.1 mol/L PBS溶液待用。生理狀態(tài)基本一致的4齡棉鈴蟲幼蟲經(jīng)注射不同毒力的Lm或者BHI(如1.2.2所述處理)48 h后，從每組處理中選取18只幼蟲，并使用微量注射器將約30個(gè)珠子注射到每個(gè)幼蟲體腔中，12 h后解剖幼蟲，解剖鏡下觀察凝膠珠的包囊程度，拍照記錄。以上實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 血細(xì)胞計(jì)數(shù) 分別對4齡棉鈴蟲幼蟲在感染Lm后的24、48和72 h時(shí)進(jìn)行采血：剪去被感染棉鈴蟲幼蟲一對腹足，取血淋巴10 μL，加入90 μL抗凝劑混勻后，置于血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。每次隨機(jī)選取被感染棉鈴蟲3頭，重復(fù)3次取平均值，以注射BHI的棉鈴蟲為對照，方法相同。

1.2.6 棉鈴蟲全蟲及體內(nèi)不同部分(腸道、血淋巴、體液)載菌量的測定 將感染Lm后的棉鈴蟲體表消毒后，無菌獲取棉鈴蟲全蟲或者體內(nèi)不同部分(腸道、血淋巴、體液)，在裝有1 mL BHI的離心管中充分剪碎碾勻，用10 μm濾器過濾去除大的碎片和組織后，取10 μL濾液于李斯特菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行平板涂布，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長曲線及菌落大小

為了保持細(xì)菌在注射棉鈴蟲時(shí)的初始濃度一致，對所用的3株Lm菌株(Lm野生株EGDe、PrfA缺失株EGDeΔprfA以及PrfA組成型高表達(dá)株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*))進(jìn)行了生長曲線的測定。如圖1所示，在營養(yǎng)豐富的BHI培養(yǎng)基中，野生型EGDe生長最快，EGDeΔprfA次之，PrfA組成型高表達(dá)株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)最慢。為了準(zhǔn)確比較這3株細(xì)菌的生長狀態(tài)，參照戴雄風(fēng)等[15]的方法，檢測了EGDe、EGDeΔprfA以及EGDeΔprfA+pERL3-prfA*的對數(shù)生長時(shí)期的倍增時(shí)間，分別為68、71和82 min，與生長曲線的結(jié)果相符。進(jìn)一步比較3株菌在固體BHI平板上的菌落大小，發(fā)現(xiàn)在相同培養(yǎng)條件下PrfA組成型高表達(dá)菌株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)的菌落(平均直徑0.46 mm)明顯比野生株EGDe(0.788 mm)

圖1 不同毒力Lm在BHI中生長曲線的測定

和PrfA缺失株EGDeΔprfA(0.784 mm)的菌落小，且具有顯著性(P﹤0.05)。由此得出,當(dāng)細(xì)菌在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長時(shí)，獨(dú)立于染色體外的多拷貝質(zhì)粒pERL3以及所攜帶基因的高表達(dá)可能會(huì)影響細(xì)菌染色體基因的表達(dá)，從而影響細(xì)菌的生長速率和菌落大小。該結(jié)論與Klumpp等[16]在大腸埃希菌中表達(dá)多拷貝質(zhì)粒pBR322以及外源R1蛋白的結(jié)果一致。

2.2 單核細(xì)胞增生李斯特菌對4齡棉鈴蟲幼蟲的致病能力

2.2.1 不同毒力單核細(xì)胞增生李斯特菌的半數(shù)致死量LD50及感染不同毒力單核細(xì)胞增生李斯特菌的棉鈴蟲的致死率 如表1所示，EGDe、EGDeΔprfA以及EGDeΔprfA+pERL3-prfA*對棉鈴蟲的LD50分別為2.56×103cfu/mL、1.98×106cfu/mL、6.63×102cfu/mL。與野生株EGDe相比，PrfA組成型高表達(dá)菌株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*有顯著性差異(P﹤0.05)，PrfA缺失株EGDeΔprfA有極顯著差異(P﹤0.01)。

圖2 棉鈴蟲在注射不同毒力Lm后不同時(shí)間段的死亡率

當(dāng)注射細(xì)菌量為105cfu/mL的不同毒力的Lm后，如圖2所示，在24 h時(shí)觀察到感染了野生株EGDe的棉鈴蟲死亡率為50.01%，而感染了高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*的棉鈴蟲的死亡率卻低于10%(僅為5.56%)，弱毒株EGDeΔprfA(注射量僅為LD50的5/6)幾乎不造成棉鈴蟲死亡；但在之后的24 h(即從注射時(shí)開始的24～48 h)內(nèi)，高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*致幼蟲的死亡率急速上升，48 h時(shí)棉鈴蟲全部死亡；EGDe對幼蟲的死亡率趨于平緩，為94.4%，72 h致棉鈴蟲100%死亡，而弱毒株EGDeΔprfA在此時(shí)間內(nèi)致棉鈴蟲死亡率幾乎為零。

表1 EGDe、EGDeΔprfA以及EGDeΔprfA+pERL3-prfA*對棉鈴蟲的半數(shù)致死量(LD50)

注：a、b分別表示與野生株(EGDe)相比，在同一時(shí)間內(nèi)，其他菌株對棉鈴蟲半數(shù)致死量(LD50)的顯著差異性，a:P﹤0.05，b:P﹤0.01

2.2.2 感染單核細(xì)胞增生李斯特菌后，棉鈴蟲全蟲及體內(nèi)不同部分(腸道、血淋巴、體液)的載菌量 4齡棉鈴蟲幼蟲經(jīng)注射感染不同毒力的Lm后，分別在24 h和48 h選取相同數(shù)量的幼蟲，進(jìn)行體表消毒，全蟲或者腸道、血淋巴、體液在BHI中充分剪碎碾勻，過濾除去大的碎片和組織，取適量濃度的濾液涂布Lm顯色鑒定平板，比較全蟲及體內(nèi)不同部分(腸道、血淋巴、體液)細(xì)菌的數(shù)量。結(jié)果如圖3所示，不同毒力Lm注射感染棉鈴蟲后，24 h時(shí)，盡管同一菌株在棉鈴蟲體內(nèi)的不同部位，如腸道、血淋巴和體液的載菌量無明顯差異，但不同菌株在棉鈴蟲同一組織的載菌量卻存在較大差別。其中，野生株EGDe的數(shù)量最高，達(dá)到了3.4×107cfu/mL(全蟲)，顯著高于其他菌株在體內(nèi)的活菌數(shù)，而弱毒株EGDeΔprfA的數(shù)量最低，為3.36×103cfu/mL。該結(jié)果與注射細(xì)菌后棉鈴蟲在24 h的死亡率(圖2)相符。結(jié)合各個(gè)菌株的生長曲線(圖1)和對數(shù)期的倍增時(shí)間，對于野生株EGDe在感染24 h內(nèi)表現(xiàn)出的較高毒力，認(rèn)為由于野生株EGDe在蟲體內(nèi)繁殖速度最快，從而相對于染色體上缺失了prfA的高毒株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)，表達(dá)了更多的毒力蛋白。48 h時(shí)，野生株EGDe和高毒株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)在棉鈴蟲體內(nèi)各部分的載菌量均有所上升，其中體液中的載菌量增加最為明顯，其次為腸道；而EGDeΔprfA在棉鈴蟲各部分的載菌量卻隨時(shí)間推移不斷降低，48 h時(shí)，全蟲的載菌量僅為注射量的1/100左右，暗示了棉鈴蟲的天然免疫系統(tǒng)能夠較好地抵抗弱毒株EGDeΔprfA在體內(nèi)的生長繁殖，而野生株EGDe及其高毒力突變株卻能成功突破棉鈴蟲的防御系統(tǒng)，在蟲體內(nèi)生長繁殖，從而導(dǎo)致幼蟲死亡。

圖3 棉鈴蟲感染不同毒力Lm后全蟲及腸道、血淋巴和體液的載菌量

2.2.3 不同毒力單核細(xì)胞增生李斯特菌對棉鈴蟲中腸組織的致病性 4齡棉鈴蟲幼蟲經(jīng)不同毒力Lm感染后，定時(shí)取中腸組織染色，制備病理切片。如圖4 A和B所示：注射BHI的空白對照組中腸腸壁形態(tài)完整，腸道上皮細(xì)胞(EC)排列緊密，圍食膜(PM)及微絨毛(AMP)清晰可見，上皮層與基底膜(BM)緊密接觸，這與南宮自艷等[17]的結(jié)果一致；注射24 h后，除PrfA缺失株EGDeΔprfA(弱毒)外，其余實(shí)驗(yàn)組中腸柱狀細(xì)胞(GC)已開始伸長變成長橢圓形，圍食膜仍然存在，微絨毛開始出現(xiàn)斷裂脫落，注射了EGDe的棉鈴蟲腸道上皮細(xì)胞此時(shí)已開始出現(xiàn)溶解現(xiàn)象；注射48 h后(圖4 C、D)，各實(shí)驗(yàn)組中腸局部細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)空泡化及溶解現(xiàn)象，同時(shí)注射了高毒株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)和中毒株(EGDe)的棉鈴蟲中腸細(xì)胞微絨毛斷裂脫落現(xiàn)象嚴(yán)重，而注射了弱毒株(EGDeΔprfA)的中腸細(xì)胞微絨毛清晰可見且較為完整。此外，發(fā)現(xiàn)此時(shí)感染了高毒株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)的中腸細(xì)胞出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，所剩近乎單層細(xì)胞，而感染弱毒株(EGDeΔprfA)和中毒株(EGDe)的腸細(xì)胞無明顯脫落現(xiàn)象；注射72 h后(圖4 E、F)，除弱毒株外，其余實(shí)驗(yàn)組的中腸細(xì)胞細(xì)胞核(NV)向腸腔擴(kuò)散，此時(shí)感染了高毒株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)的中腸細(xì)胞溶解脫落現(xiàn)象最為嚴(yán)重，細(xì)胞形態(tài)破壞殆盡，僅能見到殘存的圍食膜片段。以上結(jié)果顯示，Lm侵染棉鈴蟲幼蟲后，損害了棉鈴蟲中腸細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，其受損程度與Lm毒力高低正相關(guān)。

圖4 棉鈴蟲中腸腸道病理切片

2.3 單核細(xì)胞增生李斯特菌對棉鈴蟲血細(xì)胞包囊作用和數(shù)量的影響

血細(xì)胞在昆蟲免疫應(yīng)答中具有重要作用，活化的血細(xì)胞可對入侵的病原體進(jìn)行吞噬、結(jié)節(jié)和包囊。小的病原體可直接被血細(xì)胞吞噬而殺滅，較大的病原體，首先被血細(xì)胞包圍，形成囊狀，然后進(jìn)行黑化反應(yīng)被清除。病原體引發(fā)的包囊作用取決于募集的血細(xì)胞數(shù)量和形成包囊的厚度。為了確定Lm感染棉鈴蟲后引起血細(xì)胞的防御反應(yīng)和血細(xì)胞數(shù)量的波動(dòng)情況，用Lm野生株及其突變株(EGDeΔprfA、EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)感染棉鈴蟲，并如上所述(方法1.2.4和1.2.5)感染后72 h內(nèi)，檢測Lm對昆蟲血細(xì)胞的作用。

2.3.1 單核細(xì)胞增生李斯特菌對棉鈴蟲血細(xì)胞包囊作用的影響 棉鈴蟲在感染Lm 48 h時(shí)，微量注射Sephadex DEAE A-25色譜珠入體腔，12 h后，解剖幼蟲并在顯微鏡下觀察凝膠珠的包囊程度。如圖5所示,與注射BHI培養(yǎng)基的對照組相比，感染了弱毒株(EGDeΔprfA)的棉鈴蟲血細(xì)胞包裹凝膠珠的形態(tài)和厚度無明顯變化，而其他實(shí)驗(yàn)組均有明顯的抑制血細(xì)胞包囊作用的現(xiàn)象，其中感染了高毒株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)的凝膠珠外僅有少量血細(xì)胞包囊，而感染中毒株(EGDe)的血細(xì)胞包囊程度雖然有所減少，但遠(yuǎn)不及高毒株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)的減少程度。表明Lm能夠抑制棉鈴蟲血細(xì)胞的包囊作用，其抑制程度與細(xì)菌毒力正相關(guān)。

圖5 感染不同毒力Lm 48 h后棉鈴蟲血細(xì)胞對凝膠珠的包囊作用

2.3.2 棉鈴蟲血細(xì)胞數(shù)量變化 用不同毒力Lm感染棉鈴蟲后，分別于不同時(shí)間(24、48和72 h)進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖6所示，相較于對照組，各實(shí)驗(yàn)組在感染24 h后血細(xì)胞數(shù)量急劇上升，隨后不斷減少，在72 h后達(dá)到最低；且各實(shí)驗(yàn)組72 h血細(xì)胞數(shù)量均顯著低于24 h。相比感染24 h時(shí)的血細(xì)胞數(shù)量，在72 h時(shí)，感染中毒株EGDe的棉鈴蟲血細(xì)胞數(shù)量減少45%，感染高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*的棉鈴蟲血細(xì)胞數(shù)量減少71%，只有弱毒株(EGDeΔprfA)感染的棉鈴蟲保持了較高水平的血細(xì)胞數(shù)量，僅減少27%。由于棉鈴蟲的死亡與血細(xì)胞數(shù)量的破壞呈正相關(guān)[18]，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Lm感染棉鈴蟲后，不僅導(dǎo)致棉鈴蟲血細(xì)胞數(shù)量減少，而且減少的程度與細(xì)菌的毒力高低呈正相關(guān)。

圖6 感染不同毒力Lm后棉鈴蟲血細(xì)胞數(shù)量變化

3 討 論

目前已經(jīng)報(bào)道了利用多種模式宿主研究單核細(xì)胞增生李斯特菌的致病機(jī)制，如小鼠[19]、大蠟螟[7,20]、黑腹果蠅[6,21]和線蟲[22]等。每種宿主系統(tǒng)均有其操作的優(yōu)勢，同時(shí)也存在一定的限制。因此，不斷探索適合自身實(shí)際研究工作所需的模式系統(tǒng)是每位科學(xué)研究者的重要工作。

棉鈴蟲具有飼養(yǎng)方便、成本低廉、易于注射操作、實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，已作為模式昆蟲廣泛用于植物病蟲害防治的基礎(chǔ)研究，但迄今尚未有應(yīng)用于人類病原菌研究的報(bào)道。本研究利用不同毒力的3株Lm菌注射感染4齡棉鈴蟲幼蟲，比較不同毒力Lm對棉鈴蟲的致病作用以及所引起的棉鈴蟲免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同毒力的Lm均能造成棉鈴蟲死亡。其中，高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*對棉鈴蟲的半數(shù)致死量LD50最低，弱毒株EGDeΔprfA的LD50最高，且菌株之間存在顯著差異。棉鈴蟲中腸病理切片結(jié)果也顯示，不同毒力的Lm均能造成棉鈴蟲中腸細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生病理改變，且其受損程度與Lm毒力高低正相關(guān)。雖然野生株EGDe在注射棉鈴蟲24 h內(nèi)，造成蟲體死亡率顯著高于高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*和弱毒株EGDeΔprfA，但這種差異并不影響細(xì)菌對棉鈴蟲半數(shù)致死量的檢測。結(jié)合細(xì)菌在豐富培養(yǎng)基BHI中的菌落大小和生長速率結(jié)果，認(rèn)為在棉鈴蟲感染的初期(24 h及以內(nèi))，由于多拷貝質(zhì)粒的快速擴(kuò)增耗費(fèi)了大量ATP[17]，導(dǎo)致攜帶質(zhì)粒的高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*的生長受到抑制，而野生株EGDe不受質(zhì)粒影響，在棉鈴蟲體內(nèi)的繁殖速率較高，分泌出較多的毒性蛋白，從而導(dǎo)致更多的棉鈴蟲死亡。弱毒株EGDeΔprfA雖然也沒有多拷貝質(zhì)粒，但由于細(xì)菌缺失了主要的毒力調(diào)控蛋白PrfA，分泌的毒力因子最少，因此造成棉鈴蟲的死亡率最低。與此類似，野生株EGDe感染棉鈴蟲24 h時(shí)，全蟲、腸、血淋巴及體液的載菌量同樣遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*，也可能是因?yàn)橐吧闑GDe較快速的生長繁殖造成的。同理，弱毒株EGDeΔprfA隨著感染時(shí)間的延長，在棉鈴蟲體內(nèi)的活菌數(shù)逐漸減少，則可能是因?yàn)榫甑闹虏∧芰^弱，從而被激活的棉鈴蟲的免疫系統(tǒng)不斷清除而死亡，該結(jié)果與不同毒力的Lm對棉鈴蟲血細(xì)胞包囊作用的抑制以及血細(xì)胞數(shù)量的影響相符，表明Lm能在棉鈴蟲體內(nèi)生長繁殖、分泌毒性蛋白、激活棉鈴蟲的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，最終被清除或者導(dǎo)致棉鈴蟲免疫系統(tǒng)崩潰死亡。Lm對棉鈴蟲幼蟲的致病能力強(qiáng)弱與菌株毒力高低正相關(guān)。因此，我們認(rèn)為棉鈴蟲幼蟲(至少是4齡棉鈴蟲幼蟲)適合作為研究Lm致病機(jī)制的宿主模型，且可進(jìn)一步用于探究天然免疫系統(tǒng)抵御病原菌入侵的機(jī)理以及病原菌與宿主的相互作用的基礎(chǔ)研究中。盡管如此，該模型仍存在一些限制，主要表現(xiàn)在棉鈴蟲這種鱗翅目昆蟲并不具有像哺乳動(dòng)物那樣完善的獲得性免疫防御系統(tǒng)，且其最適溫度是28 ℃，而人類病原菌適合在37 ℃下生長，這可能影響某些基因的表達(dá)。因此，在運(yùn)用模型系統(tǒng)研究病原菌的致病機(jī)制時(shí)，需要考慮這些因素的影響，謹(jǐn)慎分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。