賀元川， 魯增輝， 游華建， 陳仕江

(1. 重慶市中藥研究院，重慶 400065; 2.甘孜州康定貢嘎中華蟲草產業(yè)有限責任公司，四川 康定 626000)

粉棒束孢(Isariafarinose)隸屬于擬青霉屬，可寄生于鱗翅目、膜翅目，鞘翅目等昆蟲，廣泛分布于世界各地，是自然界中控制昆蟲種群的重要因子[1]。粉棒束孢可作為性能良好的殺蟲微生物資源，廣泛應用于農業(yè)和林業(yè)的害蟲防治[2]，防止昆蟲對植被或者生態(tài)環(huán)境的破壞，但是在名貴中藥材冬蟲夏草資源的研究中發(fā)現(xiàn)，粉棒束孢是蝙蝠蛾幼蟲的主要病原菌之一[3]，嚴重影響冬蟲夏草的產量，被列為冬蟲夏草培植的重要病害，也是限制冬蟲夏草產業(yè)化的瓶頸。野外調查發(fā)現(xiàn)自然環(huán)境中粉棒束孢病害發(fā)生率較低，而在室內人工飼養(yǎng)環(huán)境中粉棒束孢的病害發(fā)生率高，嚴重影響了蝙蝠蛾幼蟲的存活率，進而影響冬蟲夏草的產量[3-4]。土壤既是土棲昆蟲的主要生長環(huán)境，也是蟲生真菌的主要棲息地，是保護蟲生真菌的良好環(huán)境和重要的接種庫。蟲生真菌未接觸到寄主昆蟲前，病原真菌以孢子形式存在于土壤中營腐生生活，有利于種群的建立延續(xù)和穩(wěn)定，對蟲生真菌流行病的發(fā)生具有十分重要的意義[5]。粉棒束孢病害調查結果推測室內飼養(yǎng)土壤環(huán)境更適合粉棒束孢的腐生，可侵染昆蟲的不同生長發(fā)育階段，導致病害規(guī)?；陌l(fā)生，野外自然環(huán)境等綜合因素導致粉棒束孢極少發(fā)生規(guī)?；l(fā)[4]。中外學者對白僵菌和綠僵菌等蟲生真菌的研究結果顯示，土壤的溫度、含水量、有機物組成以及微生物種類等對蟲生真菌宿存和毒力具有顯著影響，并認為低溫、低含水量、避光等條件有利于白僵菌孢子的宿存、菌落形成和毒力的保存，土壤中微生物的存在可能會阻礙孢子的萌發(fā)及生長[6-16]。與中高溫型蟲生真菌白僵菌和綠僵菌的研究相比，低溫型蟲生真菌粉棒束孢在土壤中關于宿存及毒力變化的研究尚未見報道[17-20]。蟲生真菌所處環(huán)境、寄主的相互作用將影響其種群動態(tài)和毒力的變化。蟲生真菌退化后常常采用寄主昆蟲感染來復壯蟲生真菌的毒力[21-22]。在冬蟲夏草培育過程中，粉棒束孢是冬蟲夏草寄主昆蟲微生物病害的主要病原菌，其種群動態(tài)和毒力將直接影響寄主昆蟲蝙蝠蛾幼蟲的存活率和冬蟲夏草的產出率。目前針對粉擬青霉的病害研究主要集中在防治、發(fā)病機理等方面，缺少粉棒束孢宿存規(guī)律、影響因子和毒力變化的研究報道[23-25]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 供試菌株粉棒束孢分離自康定蟲草基地的粉棒束孢病害死蟲，采用單孢分離法獲得的粉棒束孢菌株，在固體斜面上培養(yǎng)10 d，用0.05% 吐溫-80的無菌水溶液制備108個/ mL孢子懸液。

1.1.2 供試昆蟲 健康的3齡蝙蝠蛾幼蟲，取自海拔3 800 m的康定雅家梗蟲草基地。

1.1.3 土壤來源 野外冬蟲夏草試驗地的土壤(高山草甸土)和室內蝙蝠蛾幼蟲飼養(yǎng)土壤。

1.1.4 改良PDA培養(yǎng)基 鏈霉素 100 U/mL; 馬鈴薯200 g/L(去皮，切塊煮沸30 min，紗布過濾)，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，蒸餾水1 000 mL。滅菌后傾倒平板并置于無菌室放置1 d，備用。

1.2 方法

1.2.1 溫度對粉棒束孢宿存的影響 將所取土壤消毒干燥后分為4組，含水量55%，添加粉棒束孢含量至108個/g，重復3次，分別置于30、20、12、-18 ℃保存。同時培養(yǎng)并測定不同溫度條件下孢子萌發(fā)率，觀察菌絲生長狀況。

1.2.2 含水量對粉棒束孢宿存的影響 將所取土壤消毒干燥后分為5組，分別調節(jié)含水量(每100 g干土所含水的百分比)至25%、35%、45%、55%、65%。添加至粉棒束孢含量至108個/g，重復3次，12 ℃基地自然溫度保存。

1.2.3 土壤微生物對粉棒束孢宿存的影響 將所取的野外高山草甸土和室內飼養(yǎng)土壤分別分為2組，第1組直接加入粉棒束孢，初始含量為108個/g，第2組經過121 ℃消毒30 min后加入粉棒束孢初始含量為108個/g，土壤含水量調至55%，保存溫度12 ℃，重復3次。

1.2.4 取樣 用圓柱形取樣器(直徑4.5 mm)在試驗盒處理區(qū)內隨機5點式取樣。前60d，每10 d取樣1次, 60 d后每月取樣1次，每次取樣厚度15 cm，每次取樣后準確稱取1 g土壤，烘干并稱量干土重量，用于計算土壤中粉棒束孢含量。

1.2.5 粉棒束孢的菌落形成單位(CFU)的測定 準確稱量土壤樣品1 g，置于250 mL三角瓶中，加入100 mL含有0.05 mL吐溫-80的無菌水溶液，振蕩器上充分混勻，依次稀釋至10-7倍，用移液管取100 μL添加至含鏈霉素的PDA的培養(yǎng)基上涂布均勻，各濃度設定3個重復，20 ℃培養(yǎng)5 d后記錄菌落數(shù)，選取菌落數(shù)在10～100之間的數(shù)值作為測定依據(jù)，計算取樣點平均菌落形成單位。

1.2.6 毒力測定 分別從每組試驗宿存12個月土壤中分離粉棒束孢，選取產孢量高、萌發(fā)率高的菌株各3株，用于毒力測定。首先將分離的菌株20 ℃固體培養(yǎng)10 d后，用含有0.05%吐溫-80的無菌水洗脫制備108個/g孢子液，然后將3齡蝙蝠蛾幼蟲浸入孢子懸液10 s后取出，自然晾干水分，放入單頭盒內裸露避光飼養(yǎng)，飼喂消毒的胡蘿卜，溫度(12±1) ℃，相對含水量(55±5)%，每3 d更換一次飼料，每天觀察和記錄死亡情況，統(tǒng)計1周的死亡率。每個菌株接種10頭。同時以滅菌的孢子液和初始菌株分別做陰性對照和陽性對照。

2 結果與分析

2.1 溫度對粉棒束孢宿存及毒力的影響

溫度是影響真菌孢子萌發(fā)、宿存的重要因素之一。圖1顯示：粉棒束孢在20 ℃時萌發(fā)快，萌發(fā)率高；12 ℃時孢子萌發(fā)延遲，但整體萌發(fā)率尚未受到影響；30 ℃時孢子萌發(fā)抑制，孢子萌發(fā)率顯著下降，可能是溫度過高，導致孢子失活。粉棒束孢在20 ℃時生長7～10 d后，菌落直徑約20～25 mm，12 ℃時生長緩慢，需要15～18 d，30 ℃時菌絲生長被抑制，培養(yǎng)7～10 d后菌落菌絲稀疏，菌落較20 ℃時偏小。圖2、3顯示，相同溫度下，同等時間內，高山草甸土壤中粉棒束孢含量下降更快，低于室內土壤，這可能與二者存在的營養(yǎng)物質、微生物代謝產物等有關。30 ℃時粉棒束孢宿存量下降最快，可能因為溫度過高導致孢子失活和抑制菌絲生長，而-18 ℃時宿存量下降緩慢，1年后仍然保持在106個/g[26]。12～20 ℃時粉棒束孢整體先緩慢上升后再直線下降，保存60 d后，除低溫外粉棒束孢宿存量均直線下降，隨著溫度的升高，粉棒束孢宿存量下降更快，可能是粉棒束孢利用土壤中的營養(yǎng)物質繁殖，導致宿存量的緩慢上升，隨著營養(yǎng)物質的減少，宿存量開始下降。從上述結果可以看出，不同溫度對粉棒束孢的土壤宿存量的影響有顯著差異，高溫不利于粉棒束孢宿存，低溫環(huán)境可維持較高的菌群數(shù)量，有利于粉棒束孢的宿存，溫度適中，則可能出現(xiàn)波動，有利于粉棒束孢的傳播及病害的發(fā)生。

圖1 溫度對粉棒束孢孢子萌發(fā)率的影響

圖2 溫度對高山草甸土中粉棒束孢宿存的影響

2.2 含水量對粉棒束孢宿存及毒力的影響

蝙蝠蛾幼蟲最適生長溫度為10 ℃～12 ℃，為了更好地研究該環(huán)境下粉棒束孢宿存的情況，測定了12 ℃條件下不同含水量對粉棒束孢宿存情況的影響。圖4、5顯示不同含水量條件下隨著保存時間的延長，粉棒束孢宿存量均降低。在低含水量環(huán)境條件下(25%～35%)，粉棒束孢宿存量緩慢減少，1年后宿存量仍維持在104個/g。在中高含水量環(huán)境條件下(45%～65%)隨著含水量的增加，粉棒束孢宿存量先增加后下降，同等時間內高山草甸土壤低于室內土壤的宿存量但均降低。由于土壤來源不同，土壤中營養(yǎng)物質也有差異，對粉棒束孢的生長表現(xiàn)出不同的作用，在低含水量環(huán)境下，可能導致孢子失水等，不利于孢子的萌發(fā)和宿存，而高濕環(huán)境，孢子可快速萌發(fā)，消耗營養(yǎng)，但是因為營養(yǎng)有限，后期環(huán)境不利于孢子的宿存，隨著時間延長出現(xiàn)宿存量降低。

圖3 溫度對室內土壤中粉棒束孢宿存的影響

圖4 濕度對高山草甸土壤中粉棒束孢宿存的影響

2.3 微生物對粉棒束孢宿存的影響

粉棒束孢雖然分布廣泛，但是土壤中存在的某些微生物對其生長有一定的抑制作用，能有效防止其病害大爆發(fā)。圖6顯示土壤微生物顯著影響粉棒束孢宿存。未消毒土壤中含有豐富的微生物，部分可能競爭性抑制粉棒束孢的生長或者產生拮抗作用，導致早期宿存量的降低，隨后由于環(huán)境適應等又緩慢增長，隨著營養(yǎng)的減少再逐漸降低。消毒后的土壤微生物被殺滅，但存在的少量的微生物代謝產物抑制了粉棒束孢生長，導致粉棒束孢宿存量暫時減少，由于消毒后的土壤中微生物可作為營養(yǎng)物質，粉棒束孢宿存量降低后開始持續(xù)增長至3個月，增長量顯著高于未消毒土壤，3個月后再出現(xiàn)宿存量的緩慢降低。室內飼養(yǎng)土壤比高山草甸土壤更利于粉棒束孢的宿存，這可能與來源不同的土壤微生物種類及代謝產物、營養(yǎng)物質有關。

圖5 濕度對室內飼養(yǎng)土壤中粉棒束孢宿存的影響

圖6 土壤微生物對粉棒束孢宿存的影響

2.4 環(huán)境因子對粉棒束孢宿存后毒力的影響

微生物保存過程中，其活力與溫度、含水量、營養(yǎng)等密切相關，土壤樣品的長期保存對其微生物的種類和多樣性均有影響[27]。表1結果顯示，溫度、含水量與微生物種類對土壤中粉棒束孢宿存過程中毒力的影響顯著。粉棒束孢在同一來源土壤中保存1年后，溫度越高，毒力下降越多，低溫有利于毒力保存；含水量對毒力的影響無明顯規(guī)律，這可能與孢子對干燥和高濕環(huán)境采取不同策略所致，可能低含水量環(huán)境孢子萌發(fā)少，保存其毒力；高含水量環(huán)境孢子萌發(fā)快，重新產孢維持毒力。微生物對粉棒束孢的毒力影響具有顯著差異，在野外的高山草甸土壤中，微生物的存在不利于粉棒束孢毒力的保存，而室內飼養(yǎng)土壤環(huán)境則有利于粉棒束孢的毒力保存，這可能與土壤中微生物的種類和數(shù)量、代謝產物等有關。

表1 環(huán)境因子對粉棒束孢毒力的影響

3 討 論

粉棒束孢是一種分布廣泛的蟲生真菌，是冬蟲夏草寄主昆蟲蝙蝠蛾幼蟲的主要病原菌之一，嚴重影響人工飼養(yǎng)蝙蝠蛾幼蟲的存活率，成為限制冬蟲夏草產業(yè)化的瓶頸[4]。通過對粉棒束孢的防控，從源頭控制粉棒束孢的數(shù)量，可有效降低病害發(fā)生率。粉棒束孢在冬蟲夏草的培殖中被列為主要病害，與作為生防菌的研究方向和目的截然不同?，F(xiàn)有文獻主要是研究如何控制已經發(fā)生的粉棒束孢病害，但對其在土壤中的宿存情況、變化規(guī)律，尚未有文獻報道。為了更好地控制該病害的發(fā)生，了解其宿存和毒力的影響因素尤為重要。本研究分析了溫度、含水量、微生物對粉棒束孢宿存和毒力的影響，特別關注了蝙蝠蛾飼養(yǎng)環(huán)境下粉棒束孢的變化規(guī)律。經過1年宿存后，粉棒束孢的數(shù)量降低了99%以上，但是存活的粉棒束孢的活力基本保持在50%以上，雖然數(shù)量顯著降低，但是若此時能遇到寄主昆蟲，依然有能力侵染引起病害。作為中低溫型真菌，高溫不利于粉棒束孢的宿存，但是低溫(-18 ℃)保存1年，宿存量基本維持在106個/g以上，毒力維持在90%左右。12 ℃土壤含水量低于35%，1年后的宿存量可保存104個/g以上，含水量45%～65%，1年后宿存量基本降低至103個/g以下，其毒力降低至80%以下。不同來源的土壤中微生物對粉棒束孢表現(xiàn)出不同的抑制作用，其中野外高山草甸土壤中微生物的抑制作用更為顯著，不利于粉棒束孢的宿存，而室內飼養(yǎng)土壤由于幼蟲排泄物、飼料腐殖質等更利于宿存和毒力的保存，這與調查結果基本一致，野外的冬蟲夏草比室內培殖的冬蟲夏草更少發(fā)生粉棒束孢病害。

冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾幼蟲飼養(yǎng)的環(huán)境，相對適合粉棒束孢的宿存和毒力保存，這可能是粉棒束孢病害很難根治的原因之一。蝙蝠蛾幼蟲飼養(yǎng)的微生態(tài)環(huán)境復雜，需要綜合考慮多個因素的影響，其變化規(guī)律，對周圍幼蟲的影響及傳播等還需要進一步的研究。明確其傳播規(guī)律，才能在防控上做到有的放矢。在蝙蝠蛾幼蟲飼養(yǎng)環(huán)境中防治粉棒束孢，需要充分考慮對其蝙蝠蛾幼蟲的毒力影響，若能篩選到有效的拮抗菌株，作為生物防治菌將極大降低對蝙蝠蛾幼蟲的危害。本研究結果也為粉棒束孢作為生防菌提供了參考。