劉秋晨 唐藝萍 宋夏

[摘要]目的 探討TNIP1基因沉默對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者B細(xì)胞上BCR和CD40基因表達(dá)的影響。方法 收集2018年3月武漢大學(xué)醫(yī)院接收的20例SLE患者和20例健康體檢者的血液標(biāo)本，以慢病毒介導(dǎo)TNIP1基因沉默為切入點(diǎn)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中的TNIP1基因中mRNA的表達(dá)水平以及BCR、CD40的表達(dá)水平。結(jié)果 TNIP1基因在SLE患者中的表達(dá)量較高，干擾B細(xì)胞中TNIP1基因可導(dǎo)致B細(xì)胞中BCR和CD40表達(dá)下調(diào)。結(jié)論 TNIP1、BCR和CD40基因在B細(xì)胞中的表達(dá)具有一致的表達(dá)趨勢(shì)，提示TNIP1、BCR、CD40有一定的調(diào)控關(guān)系。

[關(guān)鍵詞]系統(tǒng)性紅斑狼瘡；B淋巴細(xì)胞；TNIP1；基因沉默

[中圖分類號(hào)] R758.62 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）5（c）-0018-05

[Abstract] Objective To explore the effect of TNIP1 gene silence on the expression of BCR and CD40 gene in B cells of patients with systemic lupus erythematosus （SLE）. Methods Blood samples from 20 SLE patients and 20 healthy subjects received in Wuhan University Hospital during March 2018 were collected. Lentiviral-mediated TNIP1 gene silence was used as an entry point. Real-time quantitative PCR was used to detect mRNA expression level as well as expression levels of BCR and CD40 in TNIP1 gene in cells. Results The expression level of TNIP1 gene was higher in SLE patients， and interference with TNIP1 gene in B cells could lead to down-regulation of BCR and CD40 expression in B cells. Conclusion The expression of TNIP1， BCR and CD40 genes in B cells show a consistent trend， suggesting that TNIP1， BCR and CD40 have a certain regulatory relationship.

[Key words] Systemic lupus erythematosus； B lymphocytes； TNIP1 gene； Gene silence

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種多發(fā)于青年女性的累及多臟器的自身免疫性炎癥性結(jié)締組織疾病。在遺傳因素、環(huán)境因素等各種因素相互作用下，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞減少、B淋巴細(xì)胞非正常增生、T抑制細(xì)胞功能降低，產(chǎn)生大量的抗體和自身抗原相互結(jié)合形成一種免疫復(fù)合物，引起機(jī)體的多系統(tǒng)損害[1]。具體表現(xiàn)有關(guān)節(jié)通、關(guān)節(jié)炎、皮膚病、胸腔積液、神經(jīng)系統(tǒng)受累、心肌炎、腎病綜合征等疾病，而其中45%以上的SLE患者臨床上有腎臟病變[2]。本研究旨在探討TNIP1（TNFAIP3-interacting protein1）基因沉默對(duì)SLE患者B細(xì)胞上BCR和CD40基因表達(dá)的影響，以期為SLE的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取武漢大學(xué)醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診2018年3月收治的20例SLE患者和20例健康體檢者（無(wú)SLE家族史；近期無(wú)感染病史）。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠、哺乳期和月經(jīng)期的婦女；凝血出血病史和出血傾向；心臟休克史，心室梗死，心肺復(fù)蘇。本研究中所有個(gè)體參與者獲得知情同意，所有人員均自愿加入本研究，血樣的采集等相關(guān)操作符合武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院的醫(yī)學(xué)倫理審查。所有參與者在空腹情況下抽取靜脈血10 ml供研究所用。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）；磁力分選柱（Miltenyi Biottc公司LS Columns，德國(guó)）；NanoDrop 2000分光光度計(jì)（Thermo公司，美國(guó)）；PCR擴(kuò)增儀（Eppendorf公司Mastercycle，德國(guó)）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI 7500 Sequence Detection System，美國(guó)）。

實(shí)驗(yàn)試劑：人外周血淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Hypaque（北京索來(lái)寶生物技術(shù)有限公司）；CD19抗體的免疫分選磁珠（德國(guó)美天旎）；RNA提取試劑盒（武漢塞維爾科技公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（Omega公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海生工生物有限公司）；RT-PCR試劑盒（上海生工生物有限公司）；瓊脂糖、溴酚藍(lán)、溴化乙錠（美國(guó)Sigma公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 293T細(xì)胞的培養(yǎng) 將培養(yǎng)基（10%血清、100 U/ml雙抗青鏈霉素）和PBS放于37℃水浴鍋中預(yù)熱，將已長(zhǎng)到80%～90%的293T細(xì)胞培養(yǎng)瓶從37℃、5%的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中取出，用無(wú)菌的移液管吸凈其中的培養(yǎng)基，加5 ml的預(yù)熱PBS洗滌1次，吸凈PBS，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。

1.3.2質(zhì)粒提取 參照Omega公司的質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.3病毒包裝 將293T細(xì)胞原先的培養(yǎng)基抽吸掉，然后轉(zhuǎn)為6 ml的無(wú)雙抗，無(wú)胎牛血清的純DMEM培養(yǎng)基，再放入恒溫培養(yǎng)箱中待用。將TNIP1-siRNA（設(shè)置為干擾組）、pLKO.1（設(shè)置為對(duì)照組）及包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G以3∶1的比例進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。即取兩只新的1.5 ml的EP管，分別加入2 μg TNIP1-siRNA、2 μg包裝質(zhì)粒（1500 ng psPAX2和500 ng pMD2.G）和2 μg pLKO.1和2 μg包裝質(zhì)粒，再分別加入200 μl純DMEM培養(yǎng)基。取12 μl羅氏轉(zhuǎn)染試劑于300 μl的純培養(yǎng)基（10%血清、100 U/ml雙抗青鏈霉素）中，常溫靜置6 min。將轉(zhuǎn)染的試劑稀釋液加入DNA稀釋液中，于室溫靜置20 min后，將混勻的物質(zhì)加入到培養(yǎng)基中，6 h后補(bǔ)加10%胎牛血清（600 μl），1%雙抗（60 μl）。分別收集48、72、96 h的細(xì)胞上清液，再用0.22 μm的過(guò)濾器過(guò)濾后放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4外周血淋巴細(xì)胞的分離 向新鮮的血液中加入同等體積的PBS，顛倒混均。取10 ml離心管向里面分別加入提前預(yù)熱至室溫的與混合后相同體積的細(xì)胞分離液。室溫、2000 r/min離心20 min。拿出一只新的10 ml離心管，用移液槍將吸出的淋巴細(xì)胞層轉(zhuǎn)移進(jìn)去，再加滿PBS溶液，使PBS溶液與淋巴細(xì)胞充分混合均勻。將上述10 ml離心管進(jìn)行離心，1500 r/min離心20 min。取出離心管，可現(xiàn)離心管底部有沉淀。用抽濾泵將上層液體抽濾掉只剩沉淀。

1.3.5免疫磁珠標(biāo)記和分選外周血CD19+ B淋巴細(xì)胞 在通過(guò)磁力架的外磁場(chǎng)中，CD19+ B淋巴細(xì)胞則被吸附在磁場(chǎng)中停留，而其他無(wú)該表面抗原的細(xì)胞不能與磁珠上的單抗特異性結(jié)合則不能停留在磁場(chǎng)中，達(dá)到分離的效果。

1.3.6 B淋巴細(xì)胞感染 各取1 ml新鮮的1640培養(yǎng)基分別加入到上述只有CD19+ B淋巴細(xì)胞的15 ml離心管中，充分吹打混合均勻。將上述混合均勻的兩管培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到8孔培養(yǎng)板中，只選4個(gè)孔用，每個(gè)孔中加入500 μl上述混合后的培養(yǎng)基，即2個(gè)孔為健康體檢者，2個(gè)孔為SLE患者。健康體檢者和SLE患者的2孔中分別各加入500 μl TNIP1-siRNA、pLKO.1病毒液，再分別加入1 μl能增加病毒感染力的poly-brene（終濃度為6 μg/ml）。將培養(yǎng)板置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中感染24 h。24 h后取出培養(yǎng)板，將每個(gè)孔中的混合液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，1600 r/min，離心10 min。取出離心管，去上清，每只離心管中加入500 μl新鮮的1640培養(yǎng)基，充分吹打混合均勻。將上述混合均勻的4只離心管中的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到新的8孔培養(yǎng)板中。

1.3.7外周血淋巴細(xì)胞總RNA提取 參照omega公司的RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.8反轉(zhuǎn)錄cDNA合成 參照試劑盒，按照說(shuō)明書操作，合成cDNA。基因組DNA去除反應(yīng)體系（表1）和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（表2）。體系配好后置于PCR擴(kuò)增儀中設(shè)置程序?yàn)?2℃，2 min；4℃，hold。體系配好后繼續(xù)置于PCR擴(kuò)增儀中設(shè)置程序?yàn)?7℃，15 min；85℃，5 s；4℃，hold；-20°C保存。

1.3.9 RT-PCR檢測(cè)TNIP1基因在B淋巴細(xì)胞中的表達(dá) 合成TNIP1引物：根據(jù)GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）登錄（登錄號(hào)BC014008.1）得TNIP1基因序列（表3）；應(yīng)用Primer Permier 5.0軟件和NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）上的序列比對(duì)功能設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：根據(jù)RT-PCR試劑盒操作說(shuō)明書配制，按表4成分配置每管20 μl的體系。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火45 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃加長(zhǎng)延伸10 min。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

ΔΔCt法：A=CT（目的基因，待測(cè)樣本）-CT（內(nèi)標(biāo)基因，待測(cè)樣本）、B=CT（目的基因，對(duì)照樣本）-CT（內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本）、K=A-B表達(dá)倍數(shù)=2-K。計(jì)算后再進(jìn)行定量分析，其中用β-actin基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行校準(zhǔn)。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料兩組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異顯著，P<0.001為差異極顯著。

2結(jié)果

2.1 TNIP1、β-actin、BCR及CD40基因溶解曲線和擴(kuò)增曲線

首先檢測(cè)TNIP1、β-actin、BCR和CD40的qRT-PCR引物質(zhì)量，圖1A（封四）顯示，所設(shè)計(jì)引物溶解曲線波形陡直，四個(gè)引物無(wú)雜峰，提示用于實(shí)驗(yàn)的引物有效，質(zhì)量較好，而且擴(kuò)增產(chǎn)物單一，因此該引物可以用于檢測(cè)TNIP1基因的表達(dá)情況。圖1B（封四）顯示，四個(gè)基因的擴(kuò)增曲線，三個(gè)復(fù)孔的重復(fù)性好，提示實(shí)驗(yàn)操作中復(fù)孔之間的差異小，操作所引起的實(shí)驗(yàn)誤差很小。

2.2 qRT-PCR檢測(cè)TNIP1 mRNA的表達(dá)水平

qRT-PCR檢測(cè)TNIP1沉默后mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，健康體檢者和SLE患者干擾組（TNIP1-siRNA）的TNIP1 mRNA表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組（pLKO.1）的TNIP1 mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.001）（圖2A）。提示慢病毒介導(dǎo)的基因沉默的效率較高，成功地使TNIP1基因在B細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。同時(shí)通過(guò)分析健康體檢者和SLE患者的TNIP1表達(dá)，結(jié)果顯示，TNIP1在SLE患者中的表達(dá)量較高（圖2B），提示TNIP1的表達(dá)異常升高可能是SLE發(fā)病的一個(gè)因素。

2.3 qRT-PCR檢測(cè)BCR和CD40 mRNA的表達(dá)水平

進(jìn)一步分析了TNIP1基因沉默后B細(xì)胞活化標(biāo)志分子BCR和CD40的mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，BCR的表達(dá)在健康體檢者中下調(diào)表達(dá)差異不明顯，但在SLE患者中表達(dá)差異明顯（P<0.001）（圖3A）；無(wú)論是SLE患者還是健康體檢者，隨著TNIP1基因的下調(diào)，干擾組（TNIP1-siRNA）的CD40表達(dá)水平低于對(duì)照組（pLKO.1）的CD40表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）（圖3B）。提示BCR、CD40基因和TNIP1基因是同步下調(diào)的，干擾B細(xì)胞中TNIP1基因可導(dǎo)致B細(xì)胞中BCR和CD40表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步提示TNIP1基因表達(dá)水平與BCR和CD40的表達(dá)存在某種相關(guān)性。

3討論

目前，SLE確切病因不明，是各種因素綜合作用的結(jié)果，目前認(rèn)為該病是在遺傳基礎(chǔ)上，某些特定的因素如環(huán)境因素，藥物、食物、細(xì)菌病毒感染等導(dǎo)致SLE的發(fā)生。其中，遺傳因素是使SLE疾病發(fā)生的重要因素，研究表明，SLE發(fā)病具有家族聚集傾向[3]。但是各種環(huán)境因素，如環(huán)境污染在SLE的發(fā)病中起到促進(jìn)作用。SLE是一種復(fù)雜的多基因性遺傳病。通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)研究及多項(xiàng)候選基因研究（genome-wide association study，GWAS）分析法分析諸多SLE患者后發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)的TNIP1基因表達(dá)異常等[4]，在對(duì)SLE的發(fā)病機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)易感基因的出現(xiàn)幫助人類在基因組層面更加深刻了解到SLE疾病，報(bào)道并證實(shí)了TNIP1為我國(guó)漢族人群SLE發(fā)病新的易感基因，提示TNIP1基因在調(diào)控自身免疫性炎癥形成方面具有重要作用[5]。迄今為止SLE尚無(wú)根治的方案，只能控制病情惡化，延長(zhǎng)生命。SLE病多侵犯育齡期女性，其發(fā)病及患病率在性別、區(qū)域及種族上存在較大差異性[6]。

TNIP1即腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白3（TNFAIP3）的相互作用蛋白1，在1999年第1次被克隆出來(lái)[7]，是一種新型的內(nèi)源性炎癥調(diào)控因子，參與免疫功能的調(diào)節(jié)[8]。人類TNIP1基因位于染色體5q32-q33.1，cDNA基因長(zhǎng)度1911 bp，有18個(gè)外顯子，外顯子1為非編碼外顯子[9]。研究認(rèn)為TNIP1基因rs7708392位點(diǎn)的突變與SLE的發(fā)生有很大關(guān)系[10]，而另有研究認(rèn)為TNIP1基因rs7708392位點(diǎn)突變與SLE發(fā)病無(wú)關(guān)[11]。綜上，TNIP1基因rs7708392位點(diǎn)的突變與SLE發(fā)病的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，TNIP1基因與免疫系統(tǒng)的關(guān)系密切[12]，分布于很多神經(jīng)、肌肉、免疫系統(tǒng)等，特別是在免疫系統(tǒng)的胸腺、骨骼肌、血液中表達(dá)活躍，而在大腦中低表達(dá)[13]。TNIP1在過(guò)表達(dá)的條件下，可以抑制腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素1等從而誘導(dǎo)NF-κB的活性來(lái)發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能[14]。

BCR是B細(xì)胞抗原受體，具有抗原結(jié)合特異性，同一個(gè)體內(nèi)，BCR的多樣性很高，可以組成容量巨大的BCR庫(kù)[14]，同時(shí)可以幫助個(gè)體識(shí)別各種各式抗原、產(chǎn)生特異性抗體[15]。BCR可直接識(shí)別完整的、天然的蛋白質(zhì)抗原、多糖或脂類抗原[16]。BCR與抗原作用時(shí)有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要作用，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞增殖信號(hào)可引起機(jī)體免疫應(yīng)答，而轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)會(huì)引起免疫耐受。這兩者的異常則可引起機(jī)體免疫應(yīng)答缺陷或自身免疫[17]。

CD40是B細(xì)胞的一種表面抗原，具有抗原結(jié)合特異性，分子量為48KD，CD40為Ⅰ型跨膜糖蛋白，其基因定位于20q11-2g13-2[18]，屬腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族成員[19]。在很多細(xì)胞中均有表達(dá)，如B細(xì)胞、上皮細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞系[20]。CD40的信號(hào)傳導(dǎo)途徑在不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)是不一樣的，正向調(diào)節(jié)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖或分化，負(fù)調(diào)節(jié)則可導(dǎo)致細(xì)胞抑制和凋亡，CD40的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是通過(guò)調(diào)節(jié)非受體型酪氨酸蛋白激酶來(lái)達(dá)成。CD40是SLE疾病領(lǐng)域研究中重要的分子之一[21]。

本研究采用病例對(duì)照分析的方法，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，把SLE患者的外周血淋巴細(xì)胞中TNIP1基因與健康體檢者的表達(dá)情況進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，SLE患者的表達(dá)情況與健康體檢者相比是上調(diào)的，可能TNIP1基因的表達(dá)上調(diào)會(huì)減少炎癥因子的釋放，TNIP1基因在活化的B細(xì)胞中特異性高表達(dá)。SLE患者中的B淋巴細(xì)胞的數(shù)目較多，也有可能是B細(xì)胞數(shù)目的增多導(dǎo)致了TNIP1基因的上調(diào)，TNIP1上調(diào)具有自身保護(hù)性。

干擾SLE患者及健康體檢者B細(xì)胞中的TNIP1基因，可以導(dǎo)致健康體檢者和SLE患者中的TNIP1 mRNA表達(dá)情況均明顯下調(diào)，干擾成功。RNA干擾B細(xì)胞中TNIP1基因?qū)е翨細(xì)胞上的BCR和CD40表達(dá)同步下調(diào)。綜上，TNIP1、BCR和CD40基因在B細(xì)胞中的表達(dá)具有一致的表達(dá)趨勢(shì)，提示TNIP1、BCR、CD40有一定的調(diào)控關(guān)系，TNIP1基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)受體后信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)影響B(tài)CR和CD40介導(dǎo)的信號(hào)途徑和BCR和CD40基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)B淋巴細(xì)胞在SLE免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響作用。TNIP1基因與SLE的發(fā)病機(jī)制有明顯的相關(guān)性。

BCR和CD40均是B淋巴細(xì)胞的抗原受體，具有特異性結(jié)合，與SLE的發(fā)病機(jī)制和機(jī)理有關(guān)。采用病毒介導(dǎo)TNIP1基因的方式導(dǎo)入B淋巴細(xì)胞中，有效沉默B細(xì)胞TNIP1基因，觀察對(duì)B細(xì)胞中的BCR和CD40 mRNA表達(dá)情況的影響。結(jié)果顯示，BCR、CD40的表達(dá)和TNIP1同步下調(diào)，提示TNIP基因的表達(dá)情況會(huì)影響B(tài)CR和CD40基因的表達(dá)，TNIP1具有調(diào)節(jié)信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，可能通過(guò)某種分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑這種方式，或者TNIP1調(diào)控B細(xì)胞活性，而BCR、CD40與B細(xì)胞活性相關(guān)，但具體的影響機(jī)制并不清楚。維持B細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定性需要如BCR、CD40等多種細(xì)胞表面受體的整合。TNIP1基因的表達(dá)會(huì)影響B(tài)CR和CD40的表達(dá)，使患者的炎癥減輕，改善免疫反應(yīng)，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)等。

綜上所述，TNIP1、BCR和CD40基因在B細(xì)胞中的表達(dá)具有一致的表達(dá)趨勢(shì)，提示TNIP1、BCR、CD40有一定的調(diào)控關(guān)系。

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（收稿日期：2018-10-29 本文編輯：任秀蘭）