范維肖，刁艷君，馬越云，郝曉柯

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710032)

外泌體是直徑為30～150 nm的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的一種細(xì)胞外囊泡，起源于細(xì)胞內(nèi)的多囊泡體(MVB)[1]，MVB通過(guò)與細(xì)胞膜融合而后將外泌體釋放到細(xì)胞外。外泌體可由多種細(xì)胞分泌并存在于諸如血液、尿液、乳汁以及膽汁等多種體液中，并且攜帶了宿主細(xì)胞來(lái)源的DNA，RNA和蛋白質(zhì)等信息[2]，因此外泌體在細(xì)胞與微環(huán)境及遠(yuǎn)隔器官之間的交流中扮演著重要的角色[3]，而體液中的外泌體可以反映疾病的狀況，許多研究都證實(shí)了外泌體攜帶的核酸、蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)等都可以作為疾病診斷的標(biāo)志物，因此外泌體也成為液體活檢領(lǐng)域重要的三大方向之一[4-6]。

雖然外泌體的功能及臨床應(yīng)用已經(jīng)被許多研究證實(shí)，但目前簡(jiǎn)便高效提純外泌體的方法依然是外泌體研究的重要限速步驟，目前常用的提取方法有超速離心法、蔗糖密度梯度離心法、PEG沉淀法、磁珠法以及膜親和柱法等[7-8]，超速離心法是外泌體提取的金標(biāo)準(zhǔn)，但超速離心法耗時(shí)耗力，并且提取率低；沉淀法雖然簡(jiǎn)單，但會(huì)同時(shí)沉淀許多雜蛋白，并且商品化試劑成本高；磁珠法適用于提取血液等起始量要求較低的生物樣本來(lái)源的外泌體，用途有限；膜親和柱法適用于提取包括細(xì)胞上清、血液及尿液等多種生物體液來(lái)源的外泌體，且操作相對(duì)簡(jiǎn)便。基于此，本研究通過(guò)常規(guī)的外泌體鑒定方法，對(duì)比了超速離心法和QIAGEN膜親和柱法提取外泌體的特點(diǎn)，為外泌體的基礎(chǔ)和臨床研究提供方法學(xué)參考。

1材料與方法

1.1 細(xì)胞株來(lái)源 前列腺癌LNCaP-AI+F由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院陶志華教授饋贈(zèng)；LNCaP-AI+F細(xì)胞用含10 g/dl炭處理血清的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)在75 cm2的玻璃培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%密度更換為含10 g/dl無(wú)外泌體血清的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞上清。

1.2 試劑和儀器 無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自吉諾生物，炭處理FBS購(gòu)自BI公司，無(wú)外泌體血清購(gòu)自上海逍鵬生物；CD63抗體購(gòu)自Abcam，ALIX與EGFR抗體購(gòu)自CST公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。超速離心法采用Beckman超高速離心機(jī)對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行離心；QIAGEN膜親和柱法所用試劑和柱子由QIAGEN公司提供，采用Beckman AllegraX-15R離心機(jī)離心。

1.3 方法

1.3.1 外泌體提?。撼匐x心法：按照THERY等[9]的文獻(xiàn)報(bào)道，收集40 ml細(xì)胞上清，300 g離心10 min去除漂浮的細(xì)胞，棄沉淀吸取上清；2 000 g離心10 min去除死細(xì)胞，棄沉淀吸取上清；10 000 g離心30 min去除細(xì)胞碎片，棄沉淀吸取細(xì)胞上清；100 000 g離心70 min，所得沉淀為外泌體和雜蛋白；PBS清洗沉淀后繼續(xù)再次100 000 g離心70 min，棄上清，用40 μl PBS重懸沉淀即為最終提取的外泌體。

QIAGEN膜親和柱法：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，收集40 ml細(xì)胞上清最終得到400 μl Buffer XE重懸的外泌體，而后將400μl外泌體加入100 kD超濾濃縮管12 000 r/min離心置換重懸液為PBS并濃縮外泌體至40 μl。

1.3.2 外泌體電鏡鑒定：吸取10 μl外泌體樣品滴于銅網(wǎng)，室溫靜置10 min；濾紙吸干銅網(wǎng)上的液體，滴加2 g/dl磷酸鎢染液10 μl負(fù)染，室溫靜置5 min，濾紙吸去多余的液體，白熾燈下干燥后透射電鏡下觀察拍照。

1.3.3 BCA蛋白定量與外泌體純度計(jì)算：收取LNCaP-AI+F細(xì)胞，300 g離心去除上清，100 μl細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，外泌體樣品無(wú)需裂解。按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，而后蛋白標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)胞裂解及兩種方法提取外泌體各取10 μl加入到96孔板，細(xì)胞裂解及外泌體設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，加入200 μl工作液與樣品37℃反應(yīng)20 min后測(cè)得吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出細(xì)胞裂解及兩種方法提取外泌體濃度。

1.3.4 Western blot鑒定外泌體蛋白表達(dá)：根據(jù)BCA測(cè)得濃度，細(xì)胞裂解與超離及膜親和柱法提取外泌體以15 μg的總蛋白量上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PVDF膜半干轉(zhuǎn)印8 min，封閉液封閉1 h，分別與一抗搖床孵育2 h后4℃冰箱過(guò)夜。第二天回收一抗，TBS洗膜三次并與對(duì)應(yīng)熒光二抗孵育1 h，之后TBS洗膜三次熒光掃描儀下掃膜觀察條帶并拍照記錄。

2結(jié)果

2.1 電鏡分析 圖1A為超速離心法提取外泌體電鏡圖，圖1B為膜親和柱法所提取外泌體電鏡圖，兩種方法均可在電鏡下觀察到外泌體結(jié)構(gòu)，且直徑均為100 nm左右，符合外泌體的粒徑分布范圍。超速離心法背景較為干凈，雜質(zhì)較少，而膜親和柱法所得外泌體電鏡下有類(lèi)似蛋白聚合物等雜質(zhì)存在。

A B

2.2 Western blot鑒定外泌體蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)中選取了外泌體的標(biāo)志蛋白ALIX以及CD63，內(nèi)參蛋白β-actin以及研究目的蛋白EGFR對(duì)兩種方法所提取的外泌體蛋白表達(dá)進(jìn)行了鑒定。圖2所示，同等上樣量，超速離心法外泌體ALIX和CD63均可見(jiàn)條帶，而膜親和柱法外泌體ALIX可見(jiàn)微弱條帶，CD63無(wú)條帶。超速離心外泌體β-actin與細(xì)胞裂解基本一致，而膜親和柱法外泌體β-actin較細(xì)胞裂解弱，超速離心提取外泌體EGFR相對(duì)細(xì)胞裂解高表達(dá)，而膜親和柱法提取外泌體這種富集的趨勢(shì)并不明顯。

2.3 Zetaview粒徑分析 見(jiàn)圖3A所示。超速離心外泌體粒徑分布峰值為116 nm，圖3B表明QIAGEN膜親和柱法外泌體樣本粒徑分布峰值為

122 nm，兩者粒徑分布均符合外泌體粒徑分布范圍。

注：Cell lysate代表細(xì)胞裂解；Exo UC為超速離心法提取外泌體；Exo QIA為QIAGEN膜親和柱法提取外泌體

圖2兩種方法提取外泌體標(biāo)志蛋白及目的蛋白鑒定

A B

2.4 外泌體電勢(shì) 外泌體電勢(shì)分析表明超速離心法提取的外泌體電勢(shì)為-23.46±2.38 mV：膜親和柱法提取外泌體電勢(shì)為-30.37±0.79 mV，較超速離心法提取外泌體電勢(shì)更為偏負(fù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.77，P<0.01)，兩者均符合外泌體的電勢(shì)分布范圍[10-11]。電勢(shì)越負(fù)，表明外泌體越穩(wěn)定[12]，超速離心外泌體負(fù)值偏小可能與較高的離心力會(huì)影響外泌體的穩(wěn)定性有關(guān)。

2.5 外泌體純度 外泌體顆粒數(shù)與蛋白濃度的比值是用于評(píng)價(jià)外泌體純度的一個(gè)指標(biāo)，比值越高表明提取的外泌體越純[7，13]。超速離心法提取的外泌體顆粒濃度與蛋白濃度比值為(9.7±1.2)×108particles/μg，高于QIAGEN膜親和柱法的(6.5±1.4)×108particles/μg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.47，P<0.01)。

3討論近年來(lái)越來(lái)越多的研究都證實(shí)了外泌體在細(xì)胞間通訊中扮演著重要的角色，特別是在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體可通過(guò)多種信號(hào)通路賦予正常細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及免疫細(xì)胞等相應(yīng)的適于腫瘤生長(zhǎng)的特性[14-15]。研究報(bào)道前列腺癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體富集SRC，IGF-1R以及GRK等多種蛋白，可以激活細(xì)胞內(nèi)的多種信號(hào)通路[16-17]，并且外泌體中的miRNA分子也已經(jīng)被廣泛報(bào)道可用于前列腺癌的臨床診斷[18-19]，因此外泌體在前列腺癌的發(fā)病機(jī)制及液體活檢中都具有重要的研究?jī)r(jià)值。

但在深入研究外泌體之前，如何從有限的生物樣本高效可靠地分離提取外泌體仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)，超速離心法是目前提取的金標(biāo)準(zhǔn)，但超高速離心機(jī)繁瑣的步驟和操作及其較低的提取率一定程度上對(duì)實(shí)驗(yàn)研究造成了限制，因此探索其它更快捷高效的提取方法可以為外泌體的后續(xù)內(nèi)容物分析和功能研究奠定良好的基礎(chǔ)。RICHARD等比較了超速離心法、沉淀法、超濾法和尺寸排阻法提取細(xì)胞上清外泌體的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)超濾法和尺寸排阻法提取外泌體純度與超速離心法相當(dāng)，但超濾法大量濃縮細(xì)胞上清費(fèi)時(shí)費(fèi)力，簡(jiǎn)便性不及超速離心法，而尺寸排阻法單次可提取樣本體積較小，不適用于需要大量外泌體的功能研究[7]；本研究通過(guò)電鏡形態(tài)比較、Western blot蛋白鑒定、Zetaview顆粒濃度、粒徑及電勢(shì)分析以及純度比較了超速離心法和QIAGEN膜親和柱法提取前列腺癌細(xì)胞上清的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種方法均可提取前列腺癌細(xì)胞上清的外泌體，超速離心法提取外泌體處理步驟繁瑣，需要超速離心機(jī)，適合對(duì)外泌體純度要求嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)，而QIAGEN膜親和柱法純度不及超速離心法，但可快速提取生物樣本來(lái)源的外泌體，適用于核酸分析等實(shí)驗(yàn)。

外泌體重要的生物學(xué)功能使得對(duì)于基礎(chǔ)研究和臨床檢測(cè)應(yīng)用都具有重要的意義，因此選擇合適的分離提取方法也成為外泌體研究的基礎(chǔ)，本文從多個(gè)方面對(duì)比了目前常用的超速離心法和QIAGEN膜親和柱法在提取細(xì)胞上清外泌體方面的優(yōu)缺點(diǎn)，希望能為外泌體內(nèi)容物分析和功能實(shí)驗(yàn)等相關(guān)研究提供參考和基礎(chǔ)。