齊詩(shī)儀，黃曉真，林 燊，楊曉婷，林 棟

（福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350122）

脆性 X 綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）患者有著不同程度的注意力缺陷、語(yǔ)言障礙等行為，是目前最常見(jiàn)的與兒童精神發(fā)育遲滯密切相關(guān)的遺傳性智力低下疾病之一［1］。其與位于Xq27.3的脆性X 智力障礙 1（fragile X mental retardation 1，F(xiàn)MR1）基因關(guān)系密切。FMR1基因突變可能導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物的缺失、減少或功能異常，從而引起FXS［2］。有研究表明敲除FMR1基因使得小鼠神經(jīng)突觸數(shù)量減少、發(fā)育異常，導(dǎo)致其認(rèn)知及自主活動(dòng)異常，這種模型鼠與FXS患者有許多相似特征［3-4］。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為督脈“入絡(luò)腦”，因而與腦的聯(lián)系密切。研究表明，電針FMR1基因敲除小鼠長(zhǎng)強(qiáng)穴能改變突觸可塑性，進(jìn)而改善腦功能［5-12］，而督脈上諸穴及以長(zhǎng)強(qiáng)穴為中心的周邊區(qū)域是否也有類似作用，尚待探索。因此，本文擬采用電針刺激督脈命門穴，觀察FMR1基因敲除小鼠大腦海馬區(qū)細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）及其磷酸化蛋白p-CREB的表達(dá)，以探討針刺命門穴在智力發(fā)育中的調(diào)控作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 FMR1基因敲除（knockout，KO）小鼠購(gòu)于美國(guó)The Jackson Laboratory公司，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（閩）2014-0001。通過(guò) PCR技術(shù)鑒定小鼠基因型，篩選FMR1基因遺傳缺失且具有躁動(dòng)不安、攻擊性突出等表現(xiàn)特征的KO純合子小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 水合氯醛（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；DNA提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］，一抗 CREB、p-CREB、β-actin（Proteintecch生物技術(shù)有限公司），二抗 Goat Anti-Rabbit IgG（北京依瑪博科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 DK-8D型電熱恒溫水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（加拿大BBI公司）；ZZ-6小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀（成都泰盟科技有限公司）；ZT-14S生物組織脫水機(jī)（湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；GS-6R Centrifuge冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；水平電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司）；HANS-200A韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京華運(yùn)安特科技有限責(zé)任公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 PCR鑒定動(dòng)物基因型 對(duì)28日齡FMR1基因敲除小鼠進(jìn)行腮叢靜脈采血，26℃水浴，按比例（血液∶Buffer TBP＝1∶2）混合后離心，去除上清液。 向沉淀物中加蛋白酶 K（Proteinase K）、裂解液（Buffer Digestion），置于56℃水浴加熱；加入Buffer PR后離心，再加入異丙醇于室溫放置后離心，向沉淀物加入75%乙醇離心，再向沉淀物加入TE Buffer后離心，得到DNA液體。于150 V、100 mA電泳20 min觀察。

2.2 分組與干預(yù) 根據(jù)基因鑒定結(jié)果，采用隨機(jī)數(shù)字表法將適齡KO小鼠分為空白組、命門組和非經(jīng)非穴組各8只。命門組：參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［13］取命門穴，即第二腰椎棘突下向下直刺；非經(jīng)非穴組：選取小鼠尾根與肛門之間凹陷旁開(kāi)約1 cm的部位。命門穴組、非經(jīng)非穴組使用華佗牌0.5寸針灸針自制成的雙極連體針（如圖1），進(jìn)針深度約13～15 mm，雙極針連接韓氏電針儀，設(shè)刺激頻率2 Hz，強(qiáng)度2 mA，連續(xù)波，每日30 min，連續(xù)干預(yù)14 d；空白組：每日于相同時(shí)間、相同條件下僅模擬抓取動(dòng)作。

圖1 雙極連體針

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 自主行為學(xué)檢測(cè) 采用小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀監(jiān)測(cè)在自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)中KO小鼠的站立次數(shù)及活動(dòng)次數(shù)，于干預(yù)后連續(xù)測(cè)試2 d。3組于自主行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后進(jìn)行取材，并將其置于－80℃保存。

2.3.2 免疫組化染色 ① 將小鼠的右側(cè)大腦置于4%多聚甲醛PBS溶液中固定，并分別浸泡于不同濃度梯度的酒精、二甲苯、蠟中進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋等步驟；② 將蠟塊進(jìn)行切片（厚度約3～5 μm），放入約40℃水中，待完全展平后將其用防脫載玻片撈起，置于37℃恒溫箱中烘片；③ 將烘好的切片置于二甲苯、酒精、超純水中，用枸櫞酸對(duì)切片進(jìn)行修復(fù)，依次滴加非特異染色阻斷劑、一抗、生物素標(biāo)記羊抗小鼠／兔IgG聚合物、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶，于室溫下孵育；④ 將切片周圍水跡吸干，在切片上滴加DAB顯色液顯色，并用蘇木素復(fù)染，晾干后用中性樹(shù)膠封片。

2.3.3 Western blot法檢測(cè)CREB、p-CREB蛋白表達(dá) 將海馬從-80℃冰箱取出稱量，按比例加入RIPA裂解液及PMSF蛋白酶抑制劑后研磨、靜置、離心，在96孔板中滴加上清液進(jìn)行蛋白定量測(cè)定。從定量完成的樣品種取出部分總蛋白，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠在適當(dāng)條件下進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將蛋白從SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)到提前用甲醇浸潤(rùn)過(guò)的PVDF膜上。按產(chǎn)品使用說(shuō)明書中比例稀釋一抗 CREB（1∶1 000）、p-CREB（1∶1 000）、βactin（1∶1 000）試劑，并加入密封袋，再將 PVDF 膜裝入其中，放入4℃孵育12 h以上。洗滌PVDF膜3 次，加入二抗（1∶10 000），在室溫下?lián)u晃孵育 1 h，隨后洗滌3次。將PVDF膜置于凝膠圖像處理系統(tǒng)，顯影及分析目標(biāo)條帶的分子量和凈吸光度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 實(shí)驗(yàn)小鼠基因鑒定表型結(jié)果 圖2顯示：1～4泳道約為400 bp，表明FMR1基因缺失，為KO純合子小鼠；5～12泳道約為131 bp和400 bp，表明FMR1基因存在，為雜合子小鼠。

圖2 PCR基因鑒定結(jié)果

3.2 3組小鼠自主行為活動(dòng)及站立次數(shù)比較 如圖3。

3.3 免疫組化法檢測(cè)各組小鼠海馬區(qū)CREB及p-CREB表達(dá) 見(jiàn)圖4、圖5。圖4示，CREB免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞呈圓形，主要表達(dá)于各組小鼠海馬CA3及齒狀回；光鏡下可見(jiàn)p-CREB免疫標(biāo)記陽(yáng)性表達(dá)，神經(jīng)元胞漿和突起內(nèi)均可見(jiàn)呈棕黃色免疫組化反應(yīng)物質(zhì)顆粒沉積，膠質(zhì)細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)，空白組陽(yáng)性顆粒表達(dá)稀疏，命門組陽(yáng)性顆粒表達(dá)明顯且排列密集，非經(jīng)非穴組陽(yáng)性顆粒表達(dá)淺淡而稀疏。

3.4 Western blot法檢測(cè)小鼠海馬區(qū)CREB及p-CREB蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)圖6、圖7。

4 討 論

圖3 3組小鼠自主活動(dòng)及站立次數(shù)比較

圖4 免疫組化法檢測(cè)小鼠海馬區(qū)CREB、p-CREB的表達(dá)（×40）

圖5 免疫組化法檢測(cè)小鼠海馬區(qū)CREB、p-CREB的表達(dá)

圖6 電針命門穴對(duì)小鼠海馬區(qū)CREB蛋白表達(dá)的影響

督脈為“陽(yáng)脈之?！?。《素問(wèn)·刺禁論》曰：“七節(jié)之旁，中有小心?！泵T穴位于督脈后正中線上兩“腎俞”穴之間的中點(diǎn)。明·張介賓所著《景岳全書》云：“命門為元?dú)庵?，為水火之宅?！惫拭T穴乃陽(yáng)氣之根本，具有調(diào)節(jié)人體陽(yáng)氣、補(bǔ)益腎陽(yáng)、固本培元之功效［14］。小兒為純陽(yáng)之體，近年來(lái)通過(guò)針刺命門穴調(diào)節(jié)陽(yáng)氣對(duì)于某些兒科疾病療效甚好［15］。海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵腦區(qū)［16］，前期研究以FMR1基因敲除小鼠為研究模型探討長(zhǎng)強(qiáng)穴改善智力低下的針灸效應(yīng)，主要關(guān)注于腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用。本研究選取針刺命門穴并在效應(yīng)蛋白中以海馬區(qū)CREB與p-CREB作為主要的研究切入點(diǎn)，從而進(jìn)一步探討針刺效應(yīng)的神經(jīng)生物機(jī)制。

圖7 電針命門穴對(duì)小鼠海馬區(qū)p-CREB蛋白表達(dá)的影響

相關(guān)研究表明，KO小鼠在自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)中活動(dòng)次數(shù)增多而站立次數(shù)減少，主要在于小鼠中樞神經(jīng)過(guò)度興奮，使得小鼠行為異常［4］。而本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，電針干預(yù)命門組小鼠活動(dòng)次數(shù)、站立次數(shù)均顯著減少，說(shuō)明電針命門穴會(huì)降低FMR1基因敲除小鼠中樞神經(jīng)興奮性，從而影響突觸可塑性，改善腦功能，促使小鼠異常行為得到改善。

細(xì)胞內(nèi)的CREB參與了長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)記憶形成和情緒產(chǎn)生的相關(guān)過(guò)程，并介導(dǎo)了對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用［17］。CREB具有整合作用，是不同通路最終共同作用的蛋白［18-19］。電針額葉可能通過(guò)影響血管性癡呆大鼠海馬區(qū)cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路傳導(dǎo)，從而提高其學(xué)習(xí)、記憶能力［20］。本課題既往研究證實(shí)，針刺長(zhǎng)強(qiáng)穴改善智力低下的起效機(jī)制與CREB激活相關(guān)［5，8］。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化檢測(cè)，結(jié)果顯示命門穴組海馬區(qū)齒狀回與CA3區(qū)的CREB蛋白表達(dá)量明顯高于空白組與非經(jīng)非穴組，進(jìn)一步說(shuō)明電針命門穴改善小鼠智力低下的起效機(jī)制與CREB表達(dá)量增加有關(guān)。而Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示3組CREB蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，分析原因可能為免疫組化法檢測(cè)部位為海馬CA3區(qū)及齒狀回，而Western blot是檢測(cè)整體腦區(qū)海馬，因此可能出現(xiàn)誤差，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步改進(jìn)方案。

針刺作為外界刺激信號(hào)刺激體表穴位，啟動(dòng)細(xì)胞膜上蛋白表達(dá)，隨后激活細(xì)胞內(nèi)PI3K激酶／Akt、MEK／ERK1／2 等多條信號(hào)傳導(dǎo)通路［21-26］，不同通路最終導(dǎo)致CREB的磷酸化和激活，在核內(nèi)啟動(dòng)mRNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白如pro-BDNF，隨后進(jìn)行蛋白加工修飾通過(guò)胞吐形式釋放到細(xì)胞外，產(chǎn)生“類遞質(zhì)”的作用，從而在神經(jīng)元抗凋亡、突觸形成以及學(xué)習(xí)記憶中起到重要作用［27］。因此，p-CREB成為重要的關(guān)注點(diǎn)。針刺對(duì)大鼠顱腦損傷后上調(diào)p-CREB的表達(dá)并呈一定規(guī)律性，提示p-CREB與顱腦損傷后腦組織的修復(fù)相關(guān)［28］。本實(shí)驗(yàn)在針刺干預(yù)后p-CREB表現(xiàn)出特異性表達(dá)，且命門組顯著性更高，進(jìn)一步說(shuō)明外源性刺激促進(jìn)信號(hào)蛋白磷酸化，且命門穴激活的效應(yīng)更大。

基于上述的研究結(jié)果表明，針刺命門穴改善小兒智力低下的針刺效應(yīng)可能和海馬CA3區(qū)與齒狀回p-CREB、CREB蛋白表達(dá)量有關(guān)。今后本課題組將進(jìn)一步展開(kāi)以皮質(zhì)、小腦為檢測(cè)部位的相關(guān)研究，進(jìn)一步豐富針刺效應(yīng)對(duì)精神發(fā)育遲滯的作用機(jī)制研究。