傅文婷，江惠華，周冰燚，趙文忠，鐘興明，朱志勇，劉曉陽，劉興章

(廣東省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所 廣東省計劃生育專科醫(yī)院國家衛(wèi)生健康委員會男性生殖與遺傳重點實驗室,廣州 510700)

非梗阻性無精癥是臨床常見的男性不育的原因，無精癥的發(fā)生機制較為復(fù)雜，與遺傳、免疫內(nèi)分泌異常等因素密切相關(guān)，如基因片段的突變，染色體的微缺失以及生殖激素水平失衡等，導(dǎo)致生精發(fā)生障礙[1-2]。其中凋亡機制的異常激活是導(dǎo)致無精癥發(fā)生的原因之一。Clusterin蛋白和Bim蛋白是與細胞凋亡密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，Bim屬Bcl-2家族，能夠誘導(dǎo)細胞的程序性凋亡，如通過激活細胞色素C途徑誘導(dǎo)caspase的級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞的凋亡，此外能夠抑制抗凋亡因子的表達，抑制其抗凋亡活性，并且能夠在翻譯及轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)細胞凋亡，其過表達可能導(dǎo)致精子在生發(fā)過程中進入異常的凋亡程度，導(dǎo)致精子的形成及成熟障礙[3]。Clusterin是一種分泌性糖蛋白，其能通過多種途徑抑制細胞凋亡程序的啟動，并且能夠誘導(dǎo)細胞的分化以及DNA的修復(fù)，對細胞周期進行調(diào)節(jié)，參與生殖、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、內(nèi)分泌系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)等作用[4]。研究顯示，Clusterin蛋白及Bim蛋白參與生精細胞的精子形成過程[5-6]。本研究主要分析Clusterin蛋白及Bim蛋白在原發(fā)性少精子癥發(fā)生及進展中的作用，為無精癥發(fā)病機制研究進一步提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年2月至2018年8月廣東省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究的32例無精癥患者睪丸組織標(biāo)本作為無精癥組，患者年齡26～41歲，平均(33.0±2.1)歲。入選標(biāo)準(zhǔn):①連續(xù)3次精液檢查無精子；②睪丸病理學(xué)檢查無精子生成；③除外隱睪、精索靜脈曲張等因素導(dǎo)致的生精障礙；④除外附睪炎等感染、免疫因素導(dǎo)致的生精障礙。選擇外傷切除睪丸組織標(biāo)本30例作為對照組，患者年齡29～47歲，平均(34.1±1.8)歲。兩組年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)廣東省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器及試劑 睪丸組織標(biāo)本(來自本院非梗阻性無精癥患者穿刺活檢標(biāo)本及外傷性睪丸切除手術(shù)標(biāo)本)，兔抗人Bim多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，兔抗人Clusterin多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，組織化學(xué)免疫染色試劑盒(浙江碧云天生物技術(shù)研究所)，羊抗兔IgG/辣根過氧化物酶(浙江碧云天生物技術(shù)研究所)，乙二胺四乙酸抗原修復(fù)液(南京建成生物技術(shù)研究所)，恒溫水浴箱、切片機、顯微鏡等儀器由本院中心實驗室提供。

1.3 染色方法 睪丸組織標(biāo)本采用免疫組織化學(xué)法進行染色，標(biāo)本常規(guī)采用40%甲醛固定后石蠟包埋，切片機連續(xù)切片，切片厚度2 μm，切片后60 ℃烤片1 h，脫蠟水化，二甲苯溶液中浸泡10 min后更換溶液重新浸泡10 min，然后用無水乙醇和95%乙醇及75%乙醇溶液依次浸泡5 min，再用3%雙氧水浸泡10 min,蒸餾水沖洗3次。然后用0.01 mmol/L枸櫞酸溶液浸泡切片，微波最大火力加熱至沸騰后冷5～10 min，反復(fù)2次，修復(fù)暴露抗原，切片自然冷卻后采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌5 min,重復(fù)3次，滴加3%過氧化氫消除內(nèi)氧化物酶活性，然后用PBS洗滌5 min，重復(fù)3次，滴加1抗，37 ℃溫育1 h，然后PBS洗滌，每次3 min,洗滌3次后滴加2抗，37 ℃溫育30 min，然后PBS洗滌，每次3 min,洗滌3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素工作液，37 ℃溫育30 min，然后PBS洗滌，每次3 min,洗滌3次，滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色，溫育5 min充分反應(yīng)，流水及蒸餾水沖洗后采用蘇木素復(fù)染2 min，流水沖洗后乙醇固定、二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4 觀察指標(biāo)和判斷方法 睪丸組織免疫組織化學(xué)標(biāo)本鏡檢觀察，采用積分法對表達情況進行評估，在400 ×光鏡下選擇5個無交叉視野， Clustering蛋白和Bim蛋白表達位置位于生精細胞的胞質(zhì)中，表現(xiàn)為淡藍色背景下褐色或棕色顆粒狀染色物質(zhì)，染色陽性強度評估為每個視野中陽性生精細胞占總細胞數(shù)的百分比，其中1%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～80%計3分，>80%計4分。染色的強度計分按染色的著色程度，其中無著色為0分，弱著色為1分，中等著色為2分，明顯著色為3分，評估總得分為陽性強度評分和染色強度評分，其中無表達為0分(-)，輕度表達為1～3分(+)，中度表達為4～7分(++)，高度表達為8～12分(+++)[7]。

2 結(jié) 果

2.1 非梗阻性無精癥患者睪丸組織Clusterin蛋白及Bim蛋白的表達情況 Clusterin蛋白及Bim蛋白主要在睪丸組織生精細胞胞質(zhì)內(nèi)表達，陽性表達者表現(xiàn)為生精細胞內(nèi)極細胞膜不均勻顆粒樣或團塊樣棕褐色染色物質(zhì)。

2.2 兩組睪丸組織Clusterin蛋白表達強度及表達陽性率比較 Clusterin蛋白在對照組睪丸組織中以強陽性表達為主，在無精癥組以中等陽性和弱陽性為主，無精癥組Clusterin蛋白表達陽性強度及陽性率均低于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組睪丸組織Clusterin蛋白表達強度及表達陽性率比較

對照組：外傷切除睪丸組織標(biāo)本；a為Z值，b為χ2值

2.3 兩組睪丸組織Bim蛋白表達強度及表達陽性率比較 Bim蛋白在對照組睪丸組織以陰性和弱陽性表達為主，在無精癥組以中等陽性和強陽性為主，無精癥組Bim蛋白陽性強度及陽性率均高于對照組(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組睪丸組織Bim蛋白表達強度及表達陽性率比較

對照組：外傷切除睪丸組織標(biāo)本；a為Z值，b為χ2值

2.4 非梗阻性無精癥患者睪丸組織Clusterin蛋白與Bim蛋白的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，Clusterin蛋白與Bim蛋白表達呈負相關(guān)(rs=-0.391,P=0.004)。見表3。

表3 非梗阻性無精癥癥患者睪丸組織Clusterin蛋白與Bim蛋白的相關(guān)性 (例)

3 討 論

無精癥是指精液中無精子檢出，是男性不育癥的主要原因之一。無精癥包括梗阻性無精癥和非梗阻性無精癥， 其中非梗阻性無精癥是指精子生成障礙或成熟障礙，引起非梗阻性無精癥的原因較多，如性激素水平異常，自身的免疫系統(tǒng)疾病以及生殖系統(tǒng)發(fā)育缺陷等。其發(fā)病機制與遺傳因素密切相關(guān)，多由于基因突變或染色體的微缺失引起。如Y染色體的無精子因子(azoospermia factors，AZF)位點的缺失，包括AZFa、AZFb、AZFc三個基因位點，其缺失均能引起精子的生成障礙[8]。此外,無精癥相關(guān)缺失基因A260G、A386G位點的多態(tài)性也與無精癥的發(fā)生密切相關(guān)[9]。有研究顯示，特發(fā)性少精子癥和無精子癥患者Pygo2基因蛋白編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性相關(guān)位點發(fā)生突變，其中單個氨基酸位點的突變能夠引起Pygo2編碼蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致精子的生成障礙，發(fā)生少精子癥或無精子癥，說明在原發(fā)性無精癥的患者中相關(guān)基因位點的表達缺陷或突變是導(dǎo)致無精癥發(fā)生的始動因素[10]。有研究顯示，精子生成障礙患者卵泡刺激素及睪丸酮等生殖相關(guān)激素的表達水平明顯下降，而且生精細胞內(nèi)的相關(guān)凋亡抗原的表達水平升高，生精細胞的凋亡指數(shù)明顯增高，提示其精原細胞的凋亡程序激活是導(dǎo)致精子生成減少的直接原因之一，與生精細胞凋亡有關(guān)的細胞因子可能在無精癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[11-12]。Clusterin蛋白及Bim蛋白均是與細胞凋亡密切相關(guān)的細胞因子。

Clusterin蛋白是一種分泌性糖蛋白，首先在睪丸中分離出來，具有細胞聚集活性，其能通過多種途徑抑制細胞凋亡程序的啟動，通過與腫瘤壞死因子相互作用減少細胞凋亡的發(fā)生[13]，也能通過抑制核因子κB和Bax/Bcl-xL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性發(fā)揮對細胞凋亡的拮抗作用[4]。Clusterin蛋白和細胞質(zhì)內(nèi)活化的Bax相互作用能夠抑制抑細胞色素C的釋放，發(fā)揮細胞保護作用。生殖系統(tǒng)是Clusterin蛋白表達豐富部位，其與睪丸的正常生理功能密切相關(guān)，Clusterin蛋白能夠抑制生精細胞及精子的凋亡。Plotton 等[14]通過對特發(fā)性無精癥及獲得性無精癥患者的睪丸組織研究發(fā)現(xiàn)，非梗阻性無精癥患者睪丸組織中Clusterin的表達下降，而獲得性無精癥患者睪丸組織中Clusterin表達水平正常，提示其可能在精子發(fā)生的始動階段發(fā)揮對生精過程的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，無精癥組Clusterin蛋白的表達強度及陽性率均明顯下降，表達缺失情況較為明顯，提示其可能參與精子生成障礙或在精子生成過程中的某個環(huán)節(jié)導(dǎo)致精原細胞的凋亡。對男性不育癥患者的研究發(fā)現(xiàn), Clusterin蛋白水平降低能夠引起精子的成熟障礙，DNA片段斷裂[15]。在非梗阻性不孕癥患者的精液及睪丸組織中均存在Clusterin蛋白低表達，提示其在精子生發(fā)及成熟過程中均有重要作用[16]。一項對精液的研究顯示[17],Clusterin蛋白的表達水平與男性能力密切相關(guān)，精液中Clusterin蛋白水平與精子活力以及體外受精率有關(guān)，精液中Clusterin蛋白水平高的男性，其配偶受孕率明顯增加，提示其在男性生育中起重要作用，可能與增加精液中精子活力及數(shù)量有關(guān)。

Bim蛋白是Bcl-2家族中BH3-only成員，能夠誘導(dǎo)細胞凋亡程序的啟動，通過激活Bax途徑，引起線粒體外膜骨架改變，導(dǎo)致其通透性改變并釋放出細胞色素C誘導(dǎo)凋亡蛋白酶活化因子1形成凋亡小體，激活caspase家族的級聯(lián)反應(yīng)，引起細胞的凋亡[18]。Bim也能通過蛋白激酶B/叉頭框蛋白O3a信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活誘導(dǎo)細胞凋亡產(chǎn)生。同時Bim能夠與Bcl-2等抗凋亡蛋白結(jié)合，降低其活動，抑制其抗凋亡作用。Bim在神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變及惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中扮演重要角色[19-20]。本研究結(jié)果顯示，無精癥組Bim蛋白存在過表達，其可能通過抑制抗凋亡相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，參與非梗阻性無精癥的發(fā)病過程，非梗阻性無精癥患者睪丸組織中Clusterin蛋白與Bim蛋白的表達呈負相關(guān)，說明其可能在細胞凋亡過程中相互調(diào)控，共同參與對睪丸生精功能的調(diào)節(jié)。

綜上所述，在非梗阻性無精癥患者睪丸組織中存在Clusterin蛋白和Bim蛋白表達異常，兩者呈負相關(guān)，提示其可能通過相互調(diào)控參與精子的發(fā)生和成熟過程，共同參與非梗阻性無精癥的發(fā)生及進展。